云克隆多因子检测技术｜标准曲线拟合实操教程

多因子检测技术是一种基于流式荧光法的多重检测技术一次实验可同时检测多个靶标分子适用于蛋白质、小分子、多肽等靶标的检测。相比传统的单因子检测方法多因子检测技术具有高通量、高灵敏度和特异性好的特点同时还能节省样本提高检测效率有着广泛的应用前景。云克隆Cloud-Clone作为国内蛋白检测试剂领域的标杆品牌重磅推出基于 Luminex xMAP 技术的多重因子检测试剂盒系列为科研工作者提供一站式多因子检测解决方案。无论是基础生命科学研究、疾病机制探索、生物标志物筛选还是临床前药物研发、药效学评价云克隆多重联检试剂盒都能为您提供稳定、高效、精准的多因子检测解决方案助力您的科研工作高效突破。流式荧光法多因子检测的免疫学原理与普通酶联免疫吸附实验相似但信号检测系统有所不同。多因子检测也可以分为双抗夹心和竞争法。双抗夹心法是通过将已知的抗体偶联在荧光微球表面待测抗原与偶联的抗体反应加入生物素化的检测抗体形成双抗夹心的结构最后加入另一荧光素以PE为例标记的链霉亲和素PE被激发后测定MFI值Median Fluorescence Intensity。MFI值的大小和样品中的靶物质浓度呈正相关。此法多用于IL6、TNFα等大分子蛋白的检测。竞争法是通过将已知的抗体偶联在荧光微球表面加入生物素化的抗原和待测抗原二者竞争结合荧光微球上的偶联抗体。样本中抗原量含量愈多结合在微球上的生物素化抗原愈少最后加入PE标记的链霉亲和素PE被激发后测定MFI值。小分子激素、药物等靶标的测定多用此法。标准曲线的绘制和拟合对于多因子检测试剂盒实验的成功至关重要。下面我们以WPS的XLS软件为例介绍云克隆公司的3因子试剂盒IS135-Multiplex Assay Kit for IL1b, IL18, BDNF的标曲拟合方法以供参考。如图1所示实验人员按照说明书将标准品从最高浓度STD1经倍比稀释至最低浓度STD6阴性对照孔为标准品稀释液STD7表格的数值部分是不同浓度标准品的MFI值。图2显示的是IL1b、IL18、BDNF标准品不同梯度的对应的浓度。图1 标准品对应的MFI值图2 标准品对应的浓度值针对这3个靶标我们分别进行标准曲线的拟合和计算。首先将IL1b这个靶标各孔的MFI值减去阴性对照孔MFI值得到校正后的MFI值如图3所示接着将校正后的MFI值和相应的标准品浓度值分别取对数以10为底以Log10MFI为X轴Log10浓度值为Y轴作XY散点图如图3所示具体方法如下选中数据点击“插入”→“图表”可以在窗口的右侧看到图表类型再点击“X Y散点图”然后得到一条6点曲线如图5所示接着在该曲线中任选一点以右键打开选择“添加趋势线格式”图表上便会弹出一个对话框可在“类型”选项中选择“多项式P”并将“顺序”设定为2阶。最后在“选项”中勾选“显示公式E”和“显示R平方值R”如图6所示点确定便会出现标准曲线的对应公式及R2值如图7所示。IL18和BDNF的标准曲线制备与上文所述一致。图3 IL1b标曲数据处理示例图图4 选择图表图5 XY散点图图6 选取拟合方式图7 带拟合公式的标曲示意图竞争法多因子试剂盒的标曲拟合和双抗法相近不同之处在于竞争法不需要扣除空白孔MFI值。我们以LMA461GeMultiplex Assay Kit for Estradiol 为例进行数据处理部分的演示。如图8所示MFI值和相应的标准品浓度值分别取对数以10为底以Log10MFI为X轴Log10浓度值为Y轴作XY散点图。后续操作和前文所述内容相同最后可得到如图9所示的标曲。图8 Estradiol 标曲数据处理示意图图9 带拟合公式的标曲示意图最后我们将多因子检测试剂盒绘制和分析标准曲线过程中常见的问题及相应的解决方案总结如下多因子检测技术凭借高通量、微量、精准、高效的核心优势完美适配多靶点协同机制研究、炎症因子谱分析、激素定量、新药药效评价等高端科研场景而标准化的标曲拟合是保障数据精准的核心关键。云克隆Cloud-Clone深耕多因子检测领域多年自主研发覆盖炎症因子、神经因子、激素、代谢指标等全品类流式荧光多因子检测试剂盒适配大分子蛋白与小分子靶标双重检测场景产品经过多轮功能验证特异性强、稳定性高、标曲拟合度优异。同时配套标准化实验SOP、一对一技术指导解决科研人员标曲拟合难、数据波动大、实验重复性差等痛点全方位助力各类多因子高通量定量科研实验高效支撑高质量科研成果产出。