免疫组织化学、免疫细胞化学与免疫荧光是基于抗原-抗体特异性结合的三大实验核心技术用于生物研究中的蛋白质定位、定量和功能分析。然而文献或抗体说明书中繁杂的简写经常让我们傻傻分不清如IHC-P、IHC-Fr、IF/ICC。「IHC诊断室」将从技术原理、样本类型、显色方法等维度对这三大技术进行区分为你在实验设计和抗体选择过程中提供理论依据。一、姓甚名谁词根区分IHC是英文字母Immunohistochemistry的简写中文名为免疫组织化学。其利用抗原抗体的特异性结合及化学反应使显色剂显色对组织切片中的蛋白质进行定位、定性或定量研究。IHC使组织维持在原始结构适用于观察细胞间连接、组织微环境及病理改变。IHC-P和IHC-Fr是两种不同的IHC技术主要在于组织样本的样式。IHC-P为石蜡切片的免疫组织化学Immunohistochemistry Paraffin。IHC-Fr为冷冻切片的免疫组织化学Immunohistochemistry Frozen。如果是使用荧光信号进行检测还可能会分为IF-PImmunofluorescence-Paraffin石蜡切片的免疫荧光和IF-FrImmunofluorescence-Frozen冰冻切片的免疫荧光。ICC的英文是Immunocytochemistry中文名为免疫细胞化学对分离的细胞样本如培养细胞、脱落细胞、细胞爬片进行蛋白质定位、定性或定量研究。目前几乎不再使用酶促显色了以荧光显色为主所以ICC/IF常一起使用特指细胞免疫荧光技术。ICC检测技术中细胞样本制备过程不像组织样本那样需要复杂的环境和繁琐的操作细胞形态更为均一空间分辨率更高适用于多种细胞学样本如干玻片、乙醇固定玻片、直接涂片、细胞离心涂片、液基细胞学样本等。IF的英文是Immunofluorescence中文名为免疫荧光不区分样本类型组织或细胞也不区分样本制备类型石蜡切片或冰冻切片区别在于检测信号是“光”而不是“颜色沉淀”。IF可进行多种荧光染色进行多重标记用于评估大分子的共定位。可通过词根来区分IHC、ICC和IF。如Histo-表示组织Cyto-表示细胞。Chemistry-指化学检测方法Fluorescence-指被激发的荧光团检测。词根释义Immuno-免疫反应如抗原与抗体的特异性结合Histo-组织细胞及其周围细胞外基质的完整结构Cyto-细胞不包含细胞外基质Chemistry化学检测如酶促反应Fluorescence荧光检测光信号检测体系二、核心本质区别2.1样本类型组织VS细胞这是区分IHC和ICC的关键。IHC是保持组织的原始结构如肝脏组织、肿瘤组织包括IHC-P和IHC-FrICC是脱离组织微环境的单个细胞、细胞团或细胞簇如培养皿中的Hela细胞以及临床诊断中常见的胸腹水、痰液、尿液、宫颈刮片、细针穿刺吸取物等临床细胞样本。2.2检测信号酶促VS荧光IHC常使用酶HRP/AP催化底物产生有色沉淀如棕褐色进行显色检测在普通光学显微镜下观察结果能够长期保存。IF使用荧光染料FITC、TRITC等在荧光显微镜下观察结果背景通常是黑的灵敏度高但容易淬灭。2.3样本制备方式仅针对组织根据样本类型可以将IHC分为石蜡切片免疫组化IHC-P和冰冻切片免疫组化IHC-Fr。石蜡切片操作复杂但能更好的保持组织的形态结构切片薄可连续观察某些显色产物如DAB可长期保存在实验中更为常用。冰冻切片能更好保存抗原活性但组织在冷冻过程中易产生冰晶破坏超微结构组织形态结构较差。IHC-P和IHC-Fr的区别如下表维度石蜡切片IHC-P冷冻切片IHC-Fr包埋剂石蜡冷冻包埋剂OCT固定先固定后切片切片前或切片后固定切片厚度基本为4μm5-50μm切片条件石蜡切片机冷冻切片机组织脱水必需非必需切片水化必需非必需抗原修复必需非必需洗涤液PBS或TBSTPBS或TBST封闭液一般用10%的二抗血清一般用10%的二抗血清为了让您一目了然我们整理了这张对照表。维度IHCICCIF样品类型组织细胞组织或细胞样品制备石蜡包埋IHC-P或冷冻切片IHC-Fr多聚甲醛固定石蜡包埋、冷冻切片或多聚甲醛固定核心样本石蜡切片、冰冻组织切片细胞爬片、离心涂片、细胞悬液组织切片或细胞样本显色系统酶促反应为主荧光显色为主荧光显色检测设备光学显微镜荧光显微镜荧光显微镜信号持续性DAB染色可长久保存暂时性暂时性多重染色酶促难荧光容易酶促难荧光容易容易分辨率较低酶促低荧光高高结果呈现酶促为棕褐色沉淀也有红色、蓝色等常见红色荧光和绿色荧光信号主要应用临床诊断组织中细胞定位回顾性研究蛋白表达定性或定量细胞水平筛查亚细胞定位蛋白共定位活细胞动态观察三、技术选择按需匹配无论是IHC、ICC还是IF理清逻辑就能避免混淆明确实验目的就能轻松选择。IHC和ICC属于应用场景范畴两者之间的差别在于样本类型。如果研究对象是肿瘤组织、器官切片等完整组织需要保留组织结构和细胞间连接或进行临床病理诊断需要选择IHC。如果研究对象是细胞系、原代细胞等需要判断细胞是否表达目的蛋白或分析单个细胞中目的蛋白的表达情况可以选择ICC技术。IF属于检测工具。无论样本是组织还是细胞采用荧光素标记抗体进行检测时均属于IF。需要明确目的蛋白在细胞内的具体定位细胞膜或细胞核或者分析蛋白是否存在共定位作用优先选择IF技术。技术推荐研究目的优势IHC-P临床病理诊断如肿瘤分型、标志物检测结果稳定可长期保存IHC-Fr对甲醛敏感的抗原检测抗原保存完整无需修复。可快速检测周期短IHC-P/IHC-Fr组织微环境研究维持组织结构ICC细胞系表达筛查操作简单高通量IF亚细胞定位共定位分析多重荧光标记分辨率高同时观察多个靶点正确解读抗体应用说明书不同抗体厂商对IHC、ICC、IF的定义存在差异在实验设计前一定要仔细核对产品说明书。如义翘神州的抗体产品会明确标注IHC-P和IHC-Fr以区分石蜡切片和冰冻切片但ICC和IF未做区分标注为ICC/IF指细胞免疫荧光。Abcam采用类似的标注体系但ICC会单独标注。结语概括来说IHC、ICC、IF都是基于抗原-抗体结合机制对组织或细胞内的特异性抗原进行定位的一种技术其核心差异在于样本类型和检测方面。在实际应用中我们需要结合样本特性、研究目的、抗体可用性等多重因素进行综合考虑严格遵循各技术的标准化操作流程以获得可靠、可重复的实验结果。