DSI523Ra01脑缺血(MCAO/R)大鼠模型一模型简介脑卒中是目前全球第三大死因其中缺血性脑血管病占比高达60%80%是脑血管病的主要类型。缺血性脑血管病引起的脑损伤不仅包括缺血期的原发性损伤还包括血流恢复后加重的继发性脑缺血再灌注损伤Cerebral Ischemia Reperfusion Injury, CIRI。再灌注损伤涉及自由基爆发、炎症级联反应、兴奋性氨基酸毒性、细胞凋亡及血脑屏障破坏等多重病理机制是导致患者神经功能预后不良的重要因素。鉴于大鼠脑血管解剖结构与人类高度相似且大脑中动脉为血栓好发部位大鼠大脑中动脉闭塞Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO模型已成为国际公认的研究脑缺血再灌注损伤的金标准动物模型。该模型采用线栓法实现血管内闭塞与再通具有无需开颅、创伤小、无需特殊设备、梗死区域恒定等突出优势。目前改良Zea Longa线栓法是大鼠MCAO/再灌注MCAO/R模型最常用的制备方法凭借良好的稳定性和可重复性已成为缺血性脑卒中基础研究与临床前药物评价不可或缺的平台工具。材料1.货号DSI523Ra012.实验动物SPF级SD大鼠雄性周龄为6w~8w体重为220g~250。三模型制作方法本模型推荐采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注MCAO/R模型具体操作步骤如下1.术前准备与麻醉称量大鼠腹腔注射麻醉大鼠插入肛温探头保持体温在37±0.5℃2.暴露动脉颈部正中切口暴露右侧颈总动脉颈内动脉和颈外动脉。使用6-0丝线在距离颈总动脉分叉4mm处结扎颈外动脉远心端在颈外动脉穿入另一根6-0丝线在靠近颈总动脉分叉处打一个活结备用3.插入线栓致缺血以动脉夹临时夹闭CCA。在距CCA分叉约3 mm处的ECA上剪一小口将线栓由此插入经CCA分叉进入ICA继续向颅内推送至遇轻微阻力即止插入深度距CCA分叉约16±1 mm此时线栓头端恰好阻断大脑中动脉起始部4.再灌注与术后护理缺血90 min后轻轻拔出线栓至ECA残端用6-0丝线结扎ECA近心端缝合颈部切口活力碘消毒。将大鼠置于加热垫上保温待清醒后常规饲养。图一. 线栓展示及手术操作图四模型评估为系统验证模型构建的成功性与可靠性本平台从神经行为、梗死体积、血脑屏障功能、组织病理、影像学及分子生物学六个层面建立标准化鉴定方案确保模型质量的可控性与可重复性。1. 神经行为学评分Zea Longa 5分制再灌注后24 h采用Zea Longa 5分制标准进行神经功能缺损评估0分无神经损伤症状1分缺血对侧前肢不能完全伸展2分行走时向对侧转圈3分行走时身体向对侧倾倒4分不能自发行走意识丧失判定标准评分13分者视为造模成功0分无缺血和4分病情过重或蛛网膜下腔出血者予以剔除。模型组平均评分应显著高于假手术组。2. TTC染色测定脑梗死体积金标准原理TTC2,3,5-三苯基氯化四氮唑在线粒体脱氢酶作用下还原为红色脂溶性物质正常脑组织染为红色梗死区因脱氢酶失活而呈白色。操作再灌注24 h后取脑于−20 °C速冻15 min由前向后做连续冠状切片厚度2 mm。将脑片置于2% TTC溶液中37 °C避光孵育10 min取出后以4%多聚甲醛固定。采用Image J软件计算梗死面积。结果模型组可见明显白色梗死灶与假手术组全脑均匀红色差异显著。3. 血脑屏障损伤鉴定3.1 伊文思蓝Evans Blue, EB染色——通透性定量检测原理EB与血浆白蛋白结合形成大分子复合物正常BBB无法透过BBB损伤时复合物外渗至脑实质通过分光光度法定量。操作再灌注24 h后经尾静脉注射2% EB溶液4 ml/kg循环2 h后行生理盐水心脏灌流至流出液清亮取缺血侧脑组织称重置于甲酰胺中60 °C孵育48 h提取染料于620 nm波长测定吸光度根据标准曲线计算EB含量μg/g脑组织。结果模型组EB含量较假手术组显著升高表明BBB通透性增加。3.2 脑组织含水量测定——间接反映BBB损伤所致血管源性水肿操作取缺血侧脑组织精密称量湿重后置于70°C烘箱中烘干至恒重约48h称量干重。按公式计算含水量含水量%湿重干重/湿重×100%。结果模型组脑组织含水量显著高于假手术组提示BBB损伤后液体外渗导致脑水肿。4. 脑组织病理学检查HE染色典型病理改变模型组可见神经元胞体缩小、核固缩深染、细胞周围间隙增宽空泡化间质水肿明显部分区域可见炎性细胞浸润。假手术组神经细胞形态正常结构清晰。5. MRI活体影像学检测T2加权成像T2WI评价脑水肿采用小动物高场强MRI如7.0 T于再灌注不同时间点行T2WI扫描获取冠状位及轴位图像。通过计算缺血侧脑组织T2信号强度及相对T2值定量评估脑水肿程度。模型组缺血区T2信号明显增高反映组织水肿及细胞毒性水肿。6. 分子生物学检测6.1 紧密连接蛋白表达——BBB结构完整性的分子基础取缺血侧脑组织匀浆提取总蛋白采用Western blot检测紧密连接核心蛋白Occludin、Claudin-5及ZO-1的表达水平。同时可采用免疫荧光双标如ZO-1与CD31共染观察紧密连接在微血管内皮细胞上的分布与连续性。6.2 炎症因子检测通过qRT-PCR或ELISA检测缺血脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的mRNA或蛋白水平模型组上述因子表达显著上调反映再灌注诱发的炎症级联反应。6.3 凋亡相关蛋白检测采用Western blot检测Bcl-2抗凋亡、Bax促凋亡及Caspase-3效应酶的蛋白表达量并计算Bcl-2/Bax比值。模型组Bax和Caspase-3表达升高Bcl-2降低Bcl-2/Bax比值下降提示神经细胞凋亡通路激活。配合TUNEL染色可原位检测凋亡细胞数。6.4 氧化应激指标测定取脑组织匀浆采用比色法检测超氧化物歧化酶SOD 和过氧化氢酶CAT 活性以及丙二醛MDA 含量。模型组SOD、CAT活性下降MDA含量升高表明氧化-抗氧化平衡被打破。图二.大鼠脑组织TTC染色图图三.脑组织伊文思蓝渗漏大体图图四.脑组织TUNEL染色结果图五.脑组织NeuN、GFAP免疫荧光双标染色结果图六.WB检测脑组织中NF-κB、Claudin-5、ZO-1蛋白表达结果综上本平台通过行为学—宏观梗死—BBB功能—组织病理—活体影像—分子标志的六级鉴定体系对脑缺血再灌注损伤大鼠模型进行系统而严格的质量控制确保模型稳定可靠为神经保护药物筛选及机制研究提供坚实的实验基础。广泛的应用场景1. 神经保护药物药效学评价该模型最广泛的应用是筛选和评价抗脑缺血再灌注损伤的候选药物。通过观察药物能否降低模型动物的神经功能缺损评分、缩小脑梗死体积、减轻脑组织病理损伤、抑制神经细胞凋亡或改善氧化应激指标来系统评估药物的神经保护效果。目前已在该模型上验证了众多中药复方及单体化合物的保护作用。2. 病理生理机制研究模型可用于探究脑缺血再灌注损伤的分子机制如氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、铁死亡、自噬及血脑屏障破坏等关键病理环节为揭示CIRI的复杂网络调控机制提供在体实验依据。3. 特定基因或信号通路研究通过结合基因干预如过表达、基因敲低或通路特异性激动剂/抑制剂模型可用于探究特定基因或信号通路在脑缺血再灌注损伤中的功能角色。4. 模拟临床并发症与合并症通过调整建模参数或联合其他干预手段该模型可模拟特定的临床场景。例如联合力竭游泳可建立“气虚血瘀型”病证结合模型采用老龄大鼠可模拟老年脑卒中患者的病理特点结合远程缺血预处理可研究缺血耐受机制。5. 联合干预策略评价模型还可用于评价药物与非药物疗法的联合干预效果如药物联合针刺、电针、经颅磁刺激或亚低温治疗等综合治疗策略。综上脑缺血再灌注损伤大鼠模型经多维度鉴定确保了其可靠性与可重复性在神经保护药物筛选、病理机制解析及转化医学研究中均具有不可替代的价值。六结语云克隆Cloud-Clone Corp.依托成熟的实验动物技术平台推出经严格多维鉴定的脑缺血再灌注损伤大鼠模型货号DSI523Ra01。本模型采用线栓法制备大脑中动脉闭塞/再灌注MCAO/R模型术后通过神经行为学评分、TTC染色测定脑梗死体积、伊文思蓝EB染色评估血脑屏障通透性、脑组织含水量测定反映脑水肿程度、HE染色观察组织病理学改变、小动物MRI活体影像学追踪以及Western blot检测紧密连接蛋白与凋亡相关蛋白表达等六级标准化鉴定体系确保模型的稳定性、可靠性与可重复性。该模型可广泛应用于神经保护药物药效学评价、CIRI病理机制解析、特定基因或信号通路功能研究以及联合干预策略评估等场景。此外云克隆同步提供模型动物脑组织石蜡切片、血清样本采集及定制化检测服务并可承接从模型构建、药物干预到病理分析、数据统计的全流程整体试验外包以一站式解决方案助力您的科研进程。云克隆始终致力于以标准化、高质量、可追溯的疾病模型及配套服务赋能全球科研工作者加速脑缺血领域从基础研究到临床转化的创新进程-。若您对模型详情或定制化方案有任何需求欢迎随时垂询我们期待与您携手攻克脑血管疾病防治难题。