作者Evil Genius大家看过一个电影么叫透明人电影里为了研发一种让人可以隐形的隐形血清开头有这么一个片段。那么从现在的角度来看其实就是运用的蛋白设计和分子动力学模拟时至今日我们当然更多的采用Ai蛋白质设计。接下来为我们的生化小课CADD计算机辅助药物设计分子对接/分子动力学做好准备今日我们分享visium HD的文献大家有条件基因组 单细胞空间 分子对接/分子动力学都学习一下多组学角度看问题会比单一组学好很多。知识积累研究对象与方法利用空间转录组学分析26例HPV阳性和阴性HNSCC系统解析肿瘤结构及肿瘤微环境的空间异质性。HPV状态差异HPV阳性HNSCC表现出更高的细胞密度、更多淋巴细胞浸润和更明显的缺氧特征同时恶性细胞的部分EMTp-EMT程度降低。发现两种p-EMT空间模式p-EMT边缘型位于肿瘤浸润前沿主要由成纤维细胞通过TGFβ信号诱导p-EMT。p-EMT核心型位于肿瘤巢核心由免疫抑制性巨噬细胞和中性粒细胞通过Oncostatin MOSM信号诱导p-EMT。重要发现两种p-EMT模式虽然最终产生相似的p-EMT恶性细胞表型但其诱导细胞、信号通路和空间位置完全不同且同一肿瘤不同区域具有较稳定的一致性说明其可能是肿瘤固有的空间组织特征。核心结论HNSCC中存在“不同微环境 → 不同细胞间通讯 → 相同p-EMT表型”的空间收敛现象这种空间异质性可能影响肿瘤侵袭、免疫逃逸并提示未来治疗可能需要针对不同p-EMT空间生态位采取不同的靶向策略。在部分口腔癌中p-EMT细胞主要富集于肿瘤浸润前沿leading edge并与更强的侵袭性相关。另一种恶性细胞状态为上皮衰老epithelial senescenceEpi-sen其上皮标志物表达升高并与EGFR抑制剂治疗反应相关。主要发现识别出反复出现的空间基因表达程序这些程序与此前scRNA-seq鉴定的恶性细胞状态相对应。发现一种新的空间炎症反应inflammatory responseInf-Resp生态位主要由靠近恶性细胞的中性粒细胞和巨噬细胞组成。Inf-Resp相关基因的高表达与独立患者队列中的较差生存预后相关。HPV阳性肿瘤具有更高的细胞密度和更明显的免疫细胞富集同时表现出不同的缺氧相关基因表达并且恶性细胞中的p-EMT减少。HPV阴性肿瘤存在两种不同的p-EMT空间生态系统肿瘤边缘型p-EMT位于肿瘤浸润前沿p-EMT细胞与成纤维细胞相邻并通过TGFβ信号发生联系。肿瘤核心型p-EMT位于肿瘤核心区域由产生Oncostatin MOSM抑瘤素M的髓系细胞诱导主要涉及巨噬细胞和中性粒细胞。结果1、利用空间转录组学ST解析HNSCC18例HPV阴性和8例HPV阳性肿瘤。1. 利用CNV区分恶性细胞和非恶性细胞由于一个Visium spot直径约 55 μm通常包含多个细胞因此首先需要判断每个spot主要由什么类型的细胞组成。研究者通过分析每个spot中的拷贝数变异copy-number aberrationsCNAs来区分恶性细胞和非恶性细胞58%的spots具有明显的CNA信号→ 推测这些spot主要由恶性肿瘤细胞组成。17%的spots几乎没有CNA信号→ 推测主要由免疫细胞和基质细胞组成。25%的spots具有中等CNA信号→ 被定义为mixed spots混合spot提示其中恶性细胞和非恶性细胞比例相近。此外在部分样本中CNA模式还能够进一步区分不同的遗传亚克隆genetic subclones并确定这些亚克隆在肿瘤中的空间分布。2. 一个spot实际上代表一个“微邻域”研究者特别强调Visium的一个spot并不是单个细胞。HE染色分析显示一个spot平均包含约 15个细胞范围约为 1–47个细胞。因此一个Visium spot实际上相当于一个小型的“细胞微邻域micro-neighborhood”其表达谱是多个细胞转录本的混合结果。尽管如此研究者认为不同spot之间的主要表达差异仍然能够反映某些优势细胞类型和细胞状态的空间变化。3. Leiden聚类 NMF识别空间表达程序为了识别这些主要的空间表达模式研究者采用了两种互补的方法Leiden clustering→ 更适合寻找离散的细胞/表达状态→ 例如不同类型的细胞群或明确的空间区域。NMFNon-negative Matrix Factorization非负矩阵分解→ 更适合寻找连续变化的表达程序。这是因为Visium数据中一个细胞类型或细胞状态在不同spot中的比例通常是连续变化的而不是简单的“有/无”。最终在不同样本中共鉴定出 837个expression programs表达程序每个表达程序都代表某个样本中特定的基因表达变化模式。结果2、空间“元程序”Spatial metaprograms揭示HNSCC的细胞类型和细胞状态为了寻找能够在不同患者中反复出现、具有稳定性的基因表达模式并进一步解析HNSCC肿瘤生态系统中的主要组成成分研究者首先根据不同表达程序之间的重叠基因数量进行聚类。对于来自多个患者、具有相似表达特征的程序研究者进一步整合形成共识性的元程序metaprogramsMPs。最终共鉴定出 16种不同的MPs并通过功能基因集富集分析以及与此前scRNA-seq鉴定的表达程序进行比较对这些MPs进行注释。值得注意的是几乎所有MPs都与一个或两个相关的单细胞表达程序高度相似。这说明即使Visium spot的分辨率有限、一个spot包含多个细胞仍然可以通过这种方法较好地识别单个细胞类型或细胞状态对应的基因表达程序。1. 8种MPs对应非恶性细胞其中 8种MPs与非恶性细胞类型相关包括免疫细胞T细胞、B细胞、巨噬细胞基质细胞成纤维细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞非恶性上皮细胞这些非恶性MPs主要出现在CNA信号较弱或缺失的spots中并且与相应细胞类型的scRNA-seq表达程序高度相似。进一步在多个HNSCC转录组队列中进行评分发现T细胞、B细胞和分泌型正常上皮secretory-normalMPs与更好的5年生存率相关。这与此前的研究结果一致。2. 7种MPs对应恶性细胞状态另外 7种MPs与恶性细胞状态相关。这些MPs主要出现在CNA信号较高的spots中并且与scRNA-seq鉴定出的恶性细胞表达程序高度一致。其中Epithelial上皮型 Senescence衰老型 Secretory-malignant恶性分泌型与更高的5年总生存率OS显著相关。而p-EMT与更低的5年OS显著相关。因此进一步支持此前的结论p-EMT是一种具有较强侵袭性、与较差临床预后相关的恶性细胞状态。3. 用两种方法解决Visium spot的“多细胞混合”问题由于一个Visium spot通常包含多个细胞因此研究者采用两种方法对spot进行细胞状态注释。方法一Dominant-MP approach将每个spot归类为得分最高的MP。也就是说一个spot中哪个细胞类型/状态对应的MP得分最高就认为它是该spot的主要dominant细胞状态。方法二Composite-MP approach进一步对每个spot进行去卷积deconvolution推断一个spot中不同MP的组成比例。因此Dominant-MP回答“这个spot主要是什么”Composite-MP回答“这个spot里面由哪些细胞/状态组成各占多少”后者能够更加精细地描述Visium的多细胞混合特征。4. 不同解剖部位存在MP富集差异利用Dominant-MP方法比较不同头颈部解剖亚区后发现整体上不同部位的MP组成比较相似但仍存在一些明显差异B细胞MP → 富集于口咽部肿瘤 T细胞MP → 富集于口咽部肿瘤 缺氧hypoxiaMP → 富集于口咽部肿瘤 骨骼肌MP → 富集于口腔肿瘤这些差异具有统计学意义ANOVAP 0.05。二、特殊发现Inf-Resp空间炎症反应MP前面15种MP基本都能够明确对应某一种恶性或非恶性细胞的scRNA-seq表达程序。但有一个MP非常特殊Inf-Respinflammatory response炎症反应MP它并不能简单对应某一种单独的细胞类型。为什么Inf-Resp特殊首先它是唯一一个与单细胞表达程序相似度较低的MP。其次Inf-Resp富集的spots具有中等程度的CNA信号。这说明这些spots很可能同时存在恶性细胞 髓系免疫细胞5. Inf-Resp主要对应巨噬细胞和中性粒细胞研究者重新分析scRNA-seq数据发现Inf-Resp基因表达特征主要对应免疫抑制性巨噬细胞 中性粒细胞但CNA分析进一步表明这些Inf-Resp spots除了髓系细胞之外还含有明显的恶性肿瘤细胞。进一步的空间去卷积分析也发现Inf-Resp spots中的恶性细胞比例明显高于其他免疫或基质细胞相关spots。因此Inf-Resp并不是简单的“炎症细胞区域”而更可能代表一个恶性细胞 免疫抑制性髓系细胞高度共定位的空间微环境。6. Inf-Resp与患者预后不良相关Inf-Resp MP与较低的总体生存率OS显著相关。因此认为Inf-Resp可能代表HNSCC中的一种具有临床意义的免疫抑制性炎症空间生态位。其核心特征可以理解为中性粒细胞/免疫抑制性巨噬细胞 ↓ 与 ↓ 恶性肿瘤细胞空间共定位 ↓ 形成 Inf-Resp空间生态位 ↓ 可能促进肿瘤恶性进展 ↓ 患者预后较差发现Inf-Resp是一个特殊的“细胞互作生态位”:免疫抑制性巨噬细胞 中性粒细胞 ↔ 恶性细胞.结果3、HPV状态影响HNSCC肿瘤生态系统的整体空间组织为了描述HNSCC肿瘤内部的整体空间组织方式研究者定义了两个定量空间指标空间一致性spatial coherence用于衡量某一种MP对应的spots是倾向于聚集在一起还是分散分布于整个肿瘤中。两两耦合评分pairwise coupling score用于衡量两个不同MP是否倾向于在空间上共同出现/共定位。1. HNSCC存在明显的“恶性—基质—免疫”三大空间区室两两耦合分析发现不同恶性细胞状态之间存在较多正向空间互作不同非恶性细胞类型之间也存在较多正向互作但恶性MP与非恶性MP之间总体以负向互作为主。进一步构建无监督空间网络将MP作为节点将显著空间互作作为边发现HNSCC整体上形成三个主要空间区室恶性区室malignant—基质区室stromal—免疫区室immune三个区室之间并不是广泛连接而主要通过少数特异性互作联系。其中最重要的连接包括p-EMT ↔ 成纤维细胞 → 位于恶性—基质界面 补体激活型成纤维细胞 ↔ 免疫细胞 → 位于基质—免疫界面这说明HNSCC并不是随机混合的细胞群而具有明显的空间生态系统分区。2. 不同细胞状态的空间聚集程度不同空间一致性分析显示骨骼肌MP → 空间一致性最高最容易形成聚集区域 Senescence衰老MP → 一致性也较高 p-EMT → 一致性较低 Endothelial内皮MP → 一致性最低说明不同细胞类型/状态在肿瘤中的空间组织方式存在明显差异。此外Inf-Resp和补体-成纤维细胞complement–fibroblast的跨肿瘤差异最大提示这两类空间生态位在不同患者中可能存在两种主要模式聚集型clustered vs 分散型dispersed二、HPV状态显著影响HNSCC空间生态系统考虑到HPV阳性和HPV阴性HNSCC在临床和病理学上存在明显差异研究者进一步比较了两者的空间组织。HPV阳性HNSCC具有更强的免疫生态系统HPV阳性肿瘤表现出淋巴细胞比例更高 免疫细胞之间的空间互作更强 淋巴细胞空间一致性更高这些特点与HPV阳性HNSCC中报道的三级淋巴结构tertiary lymphoid structuresTLS相一致。也就是说HPV阳性HNSCC具有更加成熟、组织化的免疫空间生态。3. HPV阳性肿瘤缺氧↑p-EMT↓在恶性细胞区室中HPV阳性肿瘤表现出Hypoxia ↑ p-EMT ↓也就是说HPV阳性HNSCC虽然具有更强的免疫浸润但其恶性细胞的p-EMT状态相对减少同时缺氧相关程序更加明显。为了排除解剖部位造成的影响研究者进一步只分析口咽部肿瘤。结果仍然发现Hypoxia显著增加P 3.39 × 10⁻⁴ T细胞比例呈增加趋势P 0.205 p-EMT呈降低趋势P 0.0816不过由于HPV阴性口咽癌只有2例因此后两项统计能力有限。三、HPV表达本身也存在肿瘤内异质性此前研究已经发现同一个HPV相关HNSCC内部不同恶性细胞可能存在HPV-onHPV基因表达较高 HPV-offHPV基因表达较低/缺失因此研究者进一步分析HPV转录本在不同肿瘤以及不同遗传亚克隆中的分布。结果发现肿瘤间存在明显差异不同HPV阳性肿瘤之间HPV转录本的检测比例差异很大而且这种差异超过了单纯技术因素能够解释的范围。肿瘤内不同亚克隆也存在差异在具有多个CNA定义遗传亚克隆的HPV阳性肿瘤中某些亚克隆 → HPV阳性spots相对富集 另一些亚克隆 → HPV阳性spots相对减少但这种亚克隆之间的差异总体比较温和。因此HPV阳性肿瘤并不是简单的“所有肿瘤细胞都具有相同程度的HPV表达”而是存在不同程度的HPV基因表达状态。四、最有意思的发现HPV阳性肿瘤细胞密度显著更高除了细胞组成和空间互作之外研究者还发现HPV阳性和阴性HNSCC存在非常明显的细胞密度差异。平均每个Visium spot中的细胞数量肿瘤类型 每spot中位细胞数 HPV阴性 10个 HPV阳性 26个也就是说HPV阳性肿瘤每个spot的细胞数量约为HPV阴性的2.6倍。而且这种高细胞密度并不是局限于某一种细胞恶性细胞spots ↑ 基质细胞spots ↑ 免疫细胞spots ↑因此分析认为HPV阳性的高细胞密度是整个肿瘤范围内的整体性现象而不是某一种细胞局部增多造成的。核心结论HNSCC具有高度组织化的空间生态系统可划分为恶性、基质和免疫三个主要区室而HPV状态显著重塑这一空间架构。HPV阳性HNSCC表现出更高的整体细胞密度、更强的淋巴细胞组织化和免疫互作同时恶性细胞呈现“缺氧增强、p-EMT减少”的特征。而且这部分为后面非常关键的发现做了铺垫虽然HPV阳性和阴性肿瘤整体空间架构不同但在HPV阴性HNSCC中p-EMT本身还可以通过不同的空间微环境被诱导——即肿瘤边缘的TGFβ-成纤维细胞模式以及肿瘤核心的OSM-髓系细胞模式。结果4、 分区分析揭示两种不同的p-EMT空间模式研究者接下来重点分析恶性肿瘤细胞区室内部的空间结构。根据恶性spot与非恶性细胞区室之间的距离将恶性spot划分为三个区域肿瘤边缘tumor edge与非恶性细胞spot直接相邻的恶性spot肿瘤核心tumor core位于肿瘤巢核心、距离非恶性区域较远的恶性spot肿瘤中部mid-tumor介于边缘和核心之间的恶性spot。随后研究者分析不同MP在这三个区域中的分布。1. 不同恶性细胞状态具有不同的空间分布非恶性MP基本呈现一致的空间规律非恶性区域最高 → 肿瘤边缘逐渐下降 → 肿瘤核心最低。而恶性MP的空间分布更加多样细胞周期cell cycle倾向于在肿瘤边缘达到最高缺氧hypoxia在肿瘤核心富集恶性分泌型secretory-malignant核心富集衰老senescence核心富集其他MP则表现出较弱或非单调的空间变化。值得注意的是Inf-Resp虽然主要由髓系细胞信号构成但它的空间分布却类似于恶性MP即非恶性区域最低而在恶性区域升高。这进一步支持Inf-Resp实际上代表髓系细胞与恶性细胞共同构成的空间生态位。二、发现两种截然不同的p-EMT空间模式此前研究认为p-EMT主要存在于肿瘤浸润前沿leading edge并且可能与邻近成纤维细胞相互作用有关。但是当研究者对单个肿瘤进行zonation分析后发现了两种完全不同的p-EMT空间模式① p-EMT edge型p-EMT主要集中在肿瘤边缘在12个肿瘤中观察到这种模式。② p-EMT core型p-EMT主要集中在肿瘤核心共有6个肿瘤表现出这种模式。因此p-EMT并不一定只存在于肿瘤边缘。它可以出现在Edge → p-EMT或者Core → p-EMT三、Visium HD进一步验证了两种模式由于传统Visium的空间分辨率有限研究者进一步利用具有更高空间分辨率的Visium HD进行验证。结果证实p-EMT core肿瘤p-EMT表达贯穿整个恶性肿瘤巢p-EMT edge肿瘤p-EMT表达主要局限于肿瘤边缘因此两种p-EMT模式并不是传统Visium低分辨率造成的假象而是真实存在的空间组织模式。四、两种p-EMT模式是肿瘤特异性的接下来一个非常重要的问题是同一个肿瘤不同区域会不会同时存在edge型和core型研究者进一步分析了一个包含100例口腔癌患者的队列。每位患者从肿瘤不同区域取出2–4个直径2 mm的组织核心制作组织芯片TMA并通过p-EMT标志物LAMC2检测p-EMT分布。将每个组织核心分为diffuse/coreedgelowmixed结果发现同一个患者不同肿瘤区域的p-EMT模式具有高度一致性。具体而言74%的患者至少有3/4个组织核心表现出相同的LAMC2模式如果这种一致性完全由随机因素造成预计只有约28%P 0.0001。因此说明p-EMT空间模式更可能是整个肿瘤固有的、肿瘤特异性的生物学特征而不是简单的取样位置造成的结果。换句话说一个肿瘤倾向于形成edge型p-EMT还是core型p-EMT可能是该肿瘤整体生态系统的稳定特征。五、p-EMT模式并不是由肿瘤组织学生长模式决定的研究者进一步探讨p-EMT edge/core是否只是不同肿瘤组织学结构造成的根据恶性spot之间的空间一致性将肿瘤分成三类肿瘤-基质分区型compartmentalized肿瘤和基质相对分离肿瘤-基质混合型intermixed肿瘤和基质高度混杂中间型intermediate结果发现p-EMT edge和p-EMT core两种模式都可以出现在这三种组织结构中。不同组织学生长模式之间p-EMT edge/core的比例没有显著差异。虽然存在一些趋势分区型 → 倾向于p-EMT edge混合型 → 倾向于p-EMT core但均没有达到统计学显著性。因此作者认为p-EMT edge/core并不是简单由肿瘤的组织学生长模式决定的。六、这一部分的核心发现这一部分是整篇文章非常关键的发现之一可以浓缩成传统认识肿瘤边缘 → 成纤维细胞 → p-EMT↓本研究发现实际上存在两种空间模式模式1p-EMT edge肿瘤边缘→ p-EMT ↑→ 传统的leading-edge模式模式2p-EMT core肿瘤核心→ p-EMT ↑→ 全新的核心型p-EMT模式最重要的结论p-EMT具有明显的空间异质性可以形成“边缘型”和“核心型”两种稳定的空间生态模式而且这种模式具有肿瘤特异性并不主要由组织学生长结构或局部取样位置决定。这为下一步非常关键的机制研究提供了问题为什么有些肿瘤在边缘产生p-EMT而另一些肿瘤却在核心产生p-EMT后文的答案就是p-EMT edge → 成纤维细胞/TGFβ驱动p-EMT core → 巨噬细胞/中性粒细胞/OSM驱动也就是说不同空间位置的p-EMT背后实际上对应不同的TME细胞通讯机制。结果5、 p-EMT edge和p-EMT core代表两种不同的肿瘤生态系统为了研究不同p-EMT空间模式背后的差异同时避免HPV状态这一混杂因素的影响研究者后续分析仅纳入HPV阴性HNSCC。研究者比较了p-EMT edge和p-EMT core两组肿瘤的多个特征包括各MP的丰度MP的空间一致性spatial coherence不同MP之间的空间耦合pairwise coupling结果发现两组肿瘤在上述多个指标上均存在广泛差异说明p-EMT edge和p-EMT core并不是简单的空间位置差异而是对应两种不同的肿瘤生态系统。1. 两种p-EMT肿瘤的细胞组成不同与p-EMT edge肿瘤相比p-EMT core肿瘤表现出B细胞spots减少恶性衰老细胞减少增殖中的恶性细胞增加Inf-Resp spots显著增加尤其值得注意的是Inf-Resp在p-EMT core肿瘤中明显富集。这提示p-EMT core与髓系炎症/免疫抑制生态位密切相关。2. 两种模式的免疫空间组织也不同空间一致性分析发现p-EMT core肿瘤中的T细胞空间一致性更低即T细胞更加分散免疫区室整体相对受到排斥而空间耦合分析显示p-EMT core肿瘤中恶性细胞与基质细胞之间的连接增强但免疫区室相对被排除。因此p-EMT core肿瘤表现出一种恶性细胞 基质/髓系细胞增强同时淋巴细胞减少/排斥的空间生态。二、最关键的发现p-EMT的“邻居”不同这是这一部分最核心的结果。p-EMT edge在p-EMT edge肿瘤中p-EMT ↔ 成纤维细胞fibroblastp-EMT主要位于肿瘤边缘并与成纤维细胞空间共定位。p-EMT core而在p-EMT core肿瘤中p-EMT ↔ Inf-Resp也就是p-EMT与由髓系细胞和恶性细胞共同构成的Inf-Resp生态位发生空间共定位。因此p-EMT edge → fibroblast-associatedp-EMT core → Inf-Resp/myeloid-associated三、进一步证明不是“100 μm尺度”的假象研究者进一步分析更精细的spot内共定位而不是只观察约100 μm尺度的邻域。他们首先找出p-EMT占优势的spots然后根据是否同时表达Fibroblast MPInf-Resp MP两者进行分组。结果非常明确p-EMT edgep-EMT Fibroblast显著富集。p-EMT corep-EMT Inf-Resp显著富集。而且在基因表达层面也观察到了同样的共现模式。这说明两种p-EMT模式的差异不是简单的远距离空间相关而是真正存在局部细胞共定位/细胞间相互作用。四、CODEX多重免疫荧光进一步验证为了在蛋白水平验证空间转录组结果研究者利用CODEX多重免疫荧光分析了一个独立的40例喉部HNSCC组织芯片TMA使用31种蛋白标志物。最终可靠识别出3个p-EMT core肿瘤6个p-EMT edge肿瘤结果与Visium完全一致。p-EMT corep-EMT细胞弥漫分布于整个恶性肿瘤巢内部p-EMT edgep-EMT细胞主要限制在肿瘤与TME交界面进一步计算p-EMT细胞到肿瘤-TME界面的距离发现p-EMT core肿瘤中的p-EMT细胞平均距离显著更远。这从蛋白水平证明了两种空间模式确实存在。五、p-EMT core中髓系细胞大量增加CODEX进一步发现p-EMT core肿瘤中肿瘤内部髓系细胞密度超过p-EMT edge肿瘤的10倍。而且两类肿瘤中p-EMT细胞的“最近邻”也不同p-EMT corep-EMT细胞 → 更接近髓系细胞而不是成纤维细胞。p-EMT edgep-EMT细胞 → 更接近成纤维细胞而不是髓系细胞。因此从空间转录组 → spot共定位 → 基因表达 → CODEX蛋白成像 → 细胞距离多个层面都得到一致结论。六、最终模型这篇文章最终提出了两个完全不同的p-EMT生态位① p-EMT edge niche肿瘤边缘↓成纤维细胞↓p-EMT细胞特点p-EMT局限于肿瘤-TME交界处与成纤维细胞高度共定位主要发生在肿瘤浸润前沿② p-EMT core niche肿瘤核心↓髓系细胞 / Inf-Resp↓p-EMT细胞特点p-EMT弥漫分布于整个肿瘤巢髓系细胞大量增加Inf-Resp显著富集淋巴细胞相对排斥恶性细胞增殖增强七、核心总结可以把这一部分浓缩成一句话HPV阴性HNSCC中存在两种截然不同的p-EMT生态系统p-EMT edge是“成纤维细胞-肿瘤边缘型”p-EMT core则是“髓系细胞-肿瘤核心型”前者主要表现为肿瘤边缘p-EMT与成纤维细胞共定位后者则表现为肿瘤核心弥漫性p-EMT、髓系细胞大量浸润以及淋巴细胞排斥。而且作者通过Visium → Visium HD → TMA → CODEX → 细胞距离分析逐层验证使这个结论非常有说服力。最值得记住的逻辑相同的p-EMT表型 ≠ 相同的微环境机制。p-EMT edgeFibroblast → p-EMTp-EMT coreMyeloid/Inf-Resp → p-EMT这也是下一部分研究TGFβ和OSM两条不同p-EMT诱导通路的直接理论基础。结果6、 p-EMT core由OSM信号介导为了进一步解释p-EMT edge和p-EMT core两种模式之间的差异研究者比较了两类p-EMT优势spotsp-EMT core位于肿瘤核心同时表达Inf-Respp-EMT edge位于肿瘤边缘同时表达fibroblast MP。重点分析了两组spots中差异表达的配体ligand和受体receptor希望寻找可能介导细胞间通讯的信号。1. 发现OSM–OSMR信号轴大多数差异表达基因实际上主要由Inf-Resp或成纤维细胞表达因此这些差异可能反映的是p-EMT细胞附近髓系细胞或成纤维细胞的影响。但有一部分配体和受体在Inf-Resp和fibroblast spots中的表达相近更可能代表两类p-EMT细胞本身的差异。其中最值得关注的是OSMROncostatin M receptor→ p-EMT core中更高OSMOncostatin M→ 主要由Inf-Resp中的髓系细胞表达进一步scRNA-seq验证发现OSMR主要表达于p-EMT细胞而OSM主要表达于巨噬细胞和中性粒细胞。因此形成了一个非常明确的细胞间通讯关系巨噬细胞/中性粒细胞↓ 分泌OSM↓p-EMT细胞上的OSMR↓p-EMT程序2. OSM是Inf-Resp髓系细胞中特别重要的信号Inf-Resp中还发现其他可能诱导EMT的配体例如IL1BSPP1这些基因也主要由巨噬细胞和中性粒细胞表达。但是它们对应的受体并没有在p-EMT core中表现出特异性增强。因此相比IL-1β和SPP1OSM–OSMR更符合p-EMT core中的特异性细胞间通讯机制。二、空间证据支持OSM–OSMR信号研究者进一步从空间层面验证OSM是否真正与p-EMT core相关。① p-EMT core中p-EMT更容易邻近Inf-Respp-EMT core肿瘤中p-EMT spots出现Inf-Resp邻居的概率显著高于p-EMT edge肿瘤。这符合旁分泌paracrine信号传递的空间要求。② Inf-Resp在p-EMT core中更加聚集Inf-Resp的空间一致性在p-EMT core肿瘤中更高。意味着Inf-Resp髓系细胞更容易形成聚集区域可能形成一个OSM分泌中心signaling hub。③ OSM主要集中在Inf-Resp中虽然整体来看OSM阳性spots比例只有约5.5%但OSM明显富集于Inf-Resp spots。尤其是在被其他Inf-Resp spots包围的Inf-Resp spots中OSM阳性率达到27.2%。说明髓系细胞聚集越明显OSM表达越突出。而这些OSM⁺ Inf-Resp区域与p-EMT区域在p-EMT core肿瘤中高度共定位。④ p-EMT细胞对OSM的敏感性更高研究者进一步发现p-EMT core中一个p-EMT spot表达OSMR的概率显著高于p-EMT edge。即使控制了每个spot中p-EMT细胞比例之后这种差异仍然存在。说明p-EMT core中的p-EMT细胞不仅更靠近OSM来源而且自身具有更高的OSMR表达因此对OSM信号更加敏感。三、体外实验验证OSM能够诱导EMT为了进一步验证OSM是否能够直接诱导p-EMT研究者使用重组OSM处理两种HNSCC细胞系并进行RNA-seq。结果发现OSM处理后EMT相关基因明显激活多个免疫相关基因上调OSMR本身也进一步升高这提示存在一个潜在的OSM → OSMR ↑ → 对OSM更加敏感的正反馈环路。相比之下SPP1IL-1β处理并没有明显诱导EMT相关基因。因此进一步支持OSM而不是SPP1或IL-1β是p-EMT core中重要的EMT诱导信号。四、OSM和TGFβ都可以诱导p-EMT此前研究已经证明TGFβ可以诱导HNSCC的p-EMT。因此作者进一步比较了OSM vs TGFβ对HNSCC细胞的作用。结果发现两种信号都能够激活一部分共同的p-EMT相关基因例如PDPNLAMC2ITGA5多种laminin多种collagen大约40%的EMT相关基因可以被OSM和TGFβ共同激活。剩余约60%的基因则表现出一定差异其中更多是TGFβ特异性激活的。总体而言TGFβ在体外诱导p-EMT的能力强于OSM。五、最重要的机制模型这部分最终建立了一个非常漂亮的“两种上游信号 → 一个共同p-EMT终点”模型p-EMT edge成纤维细胞↓TGFβ↓p-EMT细胞↓p-EMT程序p-EMT core巨噬细胞 中性粒细胞↓OSM↓OSMR⁺ p-EMT细胞↓p-EMT程序六、为什么OSM和TGFβ不同最后却产生类似的p-EMT这是文章最有意思的机制结论之一。虽然OSM和TGFβ的上游来源不同↓激活的基因也并不完全相同↓但最终p-EMT core MP ≈ p-EMT edge MP两种空间MP在整体上高度相似、几乎难以区分。说明OSM和TGFβ可能通过不同的上游细胞通讯机制最终汇聚到一个共同的p-EMT下游转录程序。因此可以概括为不同TME细胞→不同配体→不同信号通路→共同p-EMT转录状态一句话总结p-EMT edge主要由成纤维细胞来源的TGFβ驱动而p-EMT core则由巨噬细胞和中性粒细胞来源的OSM通过OSMR驱动两种机制虽然上游不同但最终汇聚到高度相似的p-EMT转录程序形成“HNSCC中不同空间微环境诱导相同恶性细胞状态”的机制模型。最后来看看方法visium数据分析visium HD数据分析生活很好有你更好。