引言上篇我们把光亲和ABPP探针的三段式结构掰开揉碎聊了一遍 —— 弹头选哪个、Linker多长合适、报告标签走哪条路线这些设计层面的门道只要耐心琢磨总能找到最优解。但说实话设计再完美的探针只要没经过系统验证在我心里就是个“半成品”。我们组早年有一批探针设计时各种模拟数据都显示“完美”结果拿去做标记实验凝胶上一片糊竞争实验完全做不出来富集到的蛋白里一半是角蛋白一半是肌动蛋白靶点影儿都没见着。后来才发现问题的根源不是设计出了岔子而是我们没做系统的活性验证。所以下篇我们从表型到细胞摄取从标记效率到特异性竞争每一层怎么操作、怎么看结果、出了问题怎么排查一起聊到位。希望能帮你们提前排雷少走几段弯路。一、 探针活性验证高分文章的质控关键探针合成出来了先别急着约质谱。翻翻近几年的高分ABPP文章无一例外都在正文或补充材料里给出了系统的探针验证数据。这不仅是给审稿人看的“面子工程”更是为了确保你后续所有标记和富集结果都是可信的、可重复的。下面这套验证体系我把它分成四个维度1. 表型水平验证活性保留的第一道关卡探针设计的第一原则是什么不是“标记效率越高越好”而是 “修饰后的探针不能丢了母体分子的生物学活性”。如果探针因为结构改动而彻底失去了对靶蛋白的结合能力或功能调控效应那后面你标记到的所有蛋白十有八九跟真正的靶点半毛钱关系都没有。拿到探针后的第一件事就是平行比较探针与母体分子在细胞层面的表现核心就盯着三个维度▶ 细胞活力/毒性CCK-8或MTT走一波看看探针和原药在相同浓度梯度下对细胞增殖或存活的影响有多大差距。我的经验是IC50的差异最好控制在5倍以内如果超过10倍说明修饰已经严重影响了结合能力基本可以准备做下一批了。▶功能表型根据你的研究体系挑最特异的指标。抗炎药就看TNF-α、IL-6这些炎症因子的分泌抗肿瘤药就看凋亡率、细胞周期分布代谢药就看葡萄糖摄取或乳酸分泌。探针必须能复现母体分子至少60%80%的功能效应否则后面数据做出来也很难解释。▶靶点通路抑制Western Blot看靶蛋白下游信号通路变化。这一步比单纯看细胞活力更有说服力——它能直接告诉你探针是否真的“拨动了”靶点对应的那条信号通路。【常见误区】有人觉得“探针只要能标记到蛋白就行活性差一点没关系”。这个想法极其危险如果探针的活性比母体分子差了100倍说明它的结合模式已经严重变形你富集到的蛋白大概率是探针在“乱枪打鸟”时粘上的非特异性蛋白跟真正的药理靶点根本不沾边。表型验证是第一道闸门过不了这一关后面做得再精致都是虚的。万一探针活性真的大幅下降怎么办别慌按优先级排查先看看是不是Linker太短报告标签的空间位阻“怼”到了结合位点——换成PEG类长Linker试试。其次考虑换修饰位点可能你选的连接位置恰好是配体与靶蛋白结合的关键区域比如氢键供体位点。如果以上都无效果断转“两步法”策略炔烃点击化学—— 把大体积的报告标签挪到标记后再加很多时候能起死回生。2. 细胞摄取与分布验证荧光成像视角表型实验通过了只能说明“探针在细胞层面有效果”但它到底进没进细胞、进了之后去了哪儿这个问题表型数据回答不了。验证方法一荧光标记探针直接成像合成带荧光基团的探针或者在炔烃探针上点击荧光染料孵育活细胞后上共聚焦显微镜① 看摄取效率。不同浓度、不同时间点下细胞内荧光强度如何如果信号弱得可怜基本就是通透性不行——这时候优先考虑降低探针极性去掉多余的极性基团或增加脂溶性。如果信号强但集中在细胞膜上不进去说明探针卡在膜上了可能需要调整Linker的亲水性。② 看分布模式。荧光主要在细胞质、细胞核还是特定细胞器如果你的靶蛋白是胞内蛋白但探针只停留在细胞膜上那后续的标记实验肯定效果不好。这种情况下可以考虑在Linker上加一个核定位信号或者换用更亲脂的探针结构帮助穿膜。③ 跟靶蛋白共定位。如果有靶蛋白的抗体或荧光融合蛋白做共定位——探针信号和靶蛋白信号重叠得越好越说明探针确实奔着靶点去的。验证方法二流式细胞术定量共聚焦看图好看但定量不精确。流式细胞术可以给每个细胞打分客观比较不同探针、不同浓度、不同时间点的摄取效率差异数据更硬。3. 标记效率验证从凝胶荧光到质谱定量表型也过了细胞也进了接下来该回答最核心的问题探针到底能不能有效地标记靶蛋白标记的信号够不够强、够不够干净方法一凝胶荧光成像——快速初筛最常用这是每个ABPP实验室的日常操作流程不复杂① 探针与细胞裂解液或活细胞孵育 → UV照射交联② 点击荧光染料比如TAMRA-N₃③ SDS-PAGE跑胶④ 荧光凝胶成像系统扫描看条带。怎么看结果▶条带数量如果凝胶上几乎看不到条带说明标记效率极低需要优化探针浓度、UV 照射时间或点击反应条件。▶条带模式高质量的探针应该呈现出清晰、可重复的条带模式而不是一片模糊的涂抹状信号后者通常意味着大量非特异性标记。▶浓度梯度设置探针浓度梯度如 0.1、0.5、1、5、10 μM观察标记信号是否随浓度增加而增强并找到饱和标记浓度。方法二Western Blot验证已知靶点如果你的母体分子有已知的靶蛋白文献里报道过的那就好办了。探针标记、富集后Western Blot检测该靶蛋白是否被有效富集。方法三定量蛋白质组学对于更系统的验证可以采用定量质谱来评估探针的标记效率和特异性。通过比较探针标记组与对照组的蛋白丰度可以定量计算每个蛋白的富集倍数。4. 竞争实验结合特异性的金标准前面三步验证回答的是“探针能不能用”。而竞争实验回答的是“探针标记的蛋白到底是不是特异性的”。▶实验原理如果探针是通过特异性结合靶蛋白的活性位点来实现标记的那么过量的母体分子应该能够竞争性地占据这些结合位点从而显著抑制探针的标记信号。反之如果某个蛋白的标记信号不能被母体分子竞争掉说明它很可能是非特异性结合蛋白。▶标准实验设计组别处理方式目的探针组仅加入探针如 1 μM基线标记水平竞争组先加入过量母体分子预孵育再加探针检测特异性结合空白对照组不加探针仅 UV 照射 点击检测非特异性背景▶关键参数怎么设① 竞争剂浓度我们一般用探针浓度的10100倍。比如探针1μM竞争剂就设10μM10×和100μM100×两个浓度一起跑。浓度越高竞争越彻底但也要注意过高浓度的母体分子可能引起非特异性效应导致假竞争。② 预孵育时间母体分子必须比探针先加进去预孵育至少30分钟最好1小时让它充分占住结合位点再加入探针进行标记。时间太短竞争效果打折扣。▶怎么看结果① 特异性靶点标记信号被竞争剂显著抑制通常抑制率 50%的蛋白很可能是探针的特异性结合蛋白。② 非特异性结合蛋白标记信号基本不受竞争剂影响的蛋白通常为非特异性结合后续数据分析中应予以排除。③ 剂量依赖性更严谨的做法是设置竞争剂的浓度梯度如 1 倍、10 倍、100 倍观察标记信号的抑制是否呈现剂量依赖性 —— 这是特异性结合的有力证据。二、 实战建议与常见坑点理论讲完了接下来聊聊实战中每个做ABPP的人几乎都会遇到的问题。1. 探针合成阶段问题现象成因解决方案双吖丙啶探针产物降解强酸、高温、长期光照全程弱光操作规避浓酸回流产物棕色瓶避光-20℃长期保存合成探针完全无生物活性修饰位点落在配体核心结合区、Linker 位阻过大查阅 SAR 文献 / 分子对接选溶剂暴露位点更换更短 PEG 炔烃 Linker多合成 2~3 种修饰异构体筛选探针杂质多背景信号高粗产物未深度纯化、副产物残留制备 HPLC 纯化至纯度95%HRMSNMR 双重鉴定结构2. 标记实验阶段问题现象成因解决方案凝胶全片模糊、背景极高探针浓度过高UV 照射超时裂解不完全点击反应配比失衡梯度下调探针浓度UV 控制 10~15 min充分裂解去除蛋白聚集体优化 CuSO₄/TCEP/TBTA 配比凝胶几乎无标记条带、信号极弱膜通透性差UV 剂量不足靶蛋白丰度低叠氮试剂失效提升探针浓度 / 延长孵育适度增加 UV 照射富集后 WB 验证更换新鲜叠氮荧光 / 生物素试剂竞争实验无明显信号抑制竞争剂倍数不足预孵育时间短探针为不可逆共价弹头探针整体特异性差竞争剂提升至 100 倍预孵育 1 h设计反向对照返回重新优化探针分子结构3. 数据解读阶段的常见问题问题现象成因解决方案质谱富集蛋白数量过多难以筛选真假靶点缺少对照、无生物学重复设置空白 竞争双对照至少 3 次生物学重复统计学筛选双重差异蛋白频繁富集骨架、分子伴侣等高丰度蛋白非特异性吸附假阳性高发蛋白重点核验 Actin、Tubulin、HSP70/90建立实验室背景蛋白库候选靶点必须开展细胞功能验证结语整套方案是我们实验室这些年的实战总结希望能帮你们把探针开发的路走得更顺一些。ABPP实验七分靠探针三分靠运气 ——而那三分运气往往就藏在别人懒得做的验证细节里。表型验证、细胞摄取、标记效率、竞争实验每一步都做到位你的数据自然经得起审稿人和同行检验。祝大家探针一次合成成功胶图条带清晰靶点一抓就中少熬几个夜多出好数据。探针验证做扎实了靶点候选名单拿到手了但这些候选蛋白里到底哪个才是药物真正作用的核心靶点常规的GO/KEGG分析给不了答案你需要的是一套能直接从差异蛋白里“揪出”转录因子、激酶、受体和已知药物靶点的分析方案还得把“药物-靶点-差异蛋白”的调控网络给画清楚。下面这套谱度众合的药物机制蛋白质组学解决方案正好能接上这一步⬇️⬇️⬇️药物机制蛋白质组学解决方案——系统解析药物诱导的蛋白质动态扰动无偏倚发现在靶和脱靶靶点客户仅需提供药物处理前后的细胞、组织、体液等实验材料及药物相关信息即可获得远超常规蛋白质组学服务的分析内容除GO、KEGG外本方案还包括Pfam结构域、亚细胞定位、WikiPathway、转录因子、Reactome、GSEA等多维功能解析。三大专属模块让您的药物机制研究更深入、更精准① 药物靶点数据库关联自动从差异蛋白中挖掘转录因子、激酶、离子通道、受体及已知药物靶点快速锁定候选分子类别。② TTD药物靶点整合网络引入药物已知靶点构建“药物-靶点-差异蛋白”层级网络全景揭示药物调控路径。③ 分子对接验证对关键蛋白与药物进行结构模拟评估结合模式与亲和力为靶点验证提供理论依据。此外我们还提供多数据库功能注释、多维度关键蛋白筛选、多维特征预测等配套分析报告参照SCI论文标准撰写数据挖掘深度更优。从方案设计到论文发表我们的资深学术顾问与生信专家团队已准备就绪为您提供全周期专业支持。参考资料1. Schnalzer D, Savic V, Cziegler C, Schnirch M, Mihovilovic MD. Diazirines beyond photoaffinity labeling: a comprehensive overview of applications in biological sciences, materials chemistry, and NMR-spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 2025;e14105. doi:10.1002/anie.2025141052. Burton NR, Kim P, Backus KM. Photoaffinity labelling strategies for mapping the small molecule-protein interactome. Org Biomol Chem. 2021;19:7792-7815. doi:10.1039/d1ob01353j3. Fang H, Peng B, Ong SY, Wu Q, Li L, Yao SQ. Recent advances in activity-based probes (ABPs) and affinity-based probes (AfBPs) for profiling of enzymes. Chem Sci. 2021;12:8288-8310. doi:10.1039/d1sc01359a4. MacKinnon AL, Taunton J. Target identification by diazirine photo-affinity labeling using click chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 2009;1(1):55-73. doi:10.1002/9780470559277.ch090213 ABPP探针合成与活性验证：从结构设计到质控全攻略（二）
引言上篇我们把光亲和ABPP探针的三段式结构掰开揉碎聊了一遍 —— 弹头选哪个、Linker多长合适、报告标签走哪条路线这些设计层面的门道只要耐心琢磨总能找到最优解。但说实话设计再完美的探针只要没经过系统验证在我心里就是个“半成品”。我们组早年有一批探针设计时各种模拟数据都显示“完美”结果拿去做标记实验凝胶上一片糊竞争实验完全做不出来富集到的蛋白里一半是角蛋白一半是肌动蛋白靶点影儿都没见着。后来才发现问题的根源不是设计出了岔子而是我们没做系统的活性验证。所以下篇我们从表型到细胞摄取从标记效率到特异性竞争每一层怎么操作、怎么看结果、出了问题怎么排查一起聊到位。希望能帮你们提前排雷少走几段弯路。一、 探针活性验证高分文章的质控关键探针合成出来了先别急着约质谱。翻翻近几年的高分ABPP文章无一例外都在正文或补充材料里给出了系统的探针验证数据。这不仅是给审稿人看的“面子工程”更是为了确保你后续所有标记和富集结果都是可信的、可重复的。下面这套验证体系我把它分成四个维度1. 表型水平验证活性保留的第一道关卡探针设计的第一原则是什么不是“标记效率越高越好”而是 “修饰后的探针不能丢了母体分子的生物学活性”。如果探针因为结构改动而彻底失去了对靶蛋白的结合能力或功能调控效应那后面你标记到的所有蛋白十有八九跟真正的靶点半毛钱关系都没有。拿到探针后的第一件事就是平行比较探针与母体分子在细胞层面的表现核心就盯着三个维度▶ 细胞活力/毒性CCK-8或MTT走一波看看探针和原药在相同浓度梯度下对细胞增殖或存活的影响有多大差距。我的经验是IC50的差异最好控制在5倍以内如果超过10倍说明修饰已经严重影响了结合能力基本可以准备做下一批了。▶功能表型根据你的研究体系挑最特异的指标。抗炎药就看TNF-α、IL-6这些炎症因子的分泌抗肿瘤药就看凋亡率、细胞周期分布代谢药就看葡萄糖摄取或乳酸分泌。探针必须能复现母体分子至少60%80%的功能效应否则后面数据做出来也很难解释。▶靶点通路抑制Western Blot看靶蛋白下游信号通路变化。这一步比单纯看细胞活力更有说服力——它能直接告诉你探针是否真的“拨动了”靶点对应的那条信号通路。【常见误区】有人觉得“探针只要能标记到蛋白就行活性差一点没关系”。这个想法极其危险如果探针的活性比母体分子差了100倍说明它的结合模式已经严重变形你富集到的蛋白大概率是探针在“乱枪打鸟”时粘上的非特异性蛋白跟真正的药理靶点根本不沾边。表型验证是第一道闸门过不了这一关后面做得再精致都是虚的。万一探针活性真的大幅下降怎么办别慌按优先级排查先看看是不是Linker太短报告标签的空间位阻“怼”到了结合位点——换成PEG类长Linker试试。其次考虑换修饰位点可能你选的连接位置恰好是配体与靶蛋白结合的关键区域比如氢键供体位点。如果以上都无效果断转“两步法”策略炔烃点击化学—— 把大体积的报告标签挪到标记后再加很多时候能起死回生。2. 细胞摄取与分布验证荧光成像视角表型实验通过了只能说明“探针在细胞层面有效果”但它到底进没进细胞、进了之后去了哪儿这个问题表型数据回答不了。验证方法一荧光标记探针直接成像合成带荧光基团的探针或者在炔烃探针上点击荧光染料孵育活细胞后上共聚焦显微镜① 看摄取效率。不同浓度、不同时间点下细胞内荧光强度如何如果信号弱得可怜基本就是通透性不行——这时候优先考虑降低探针极性去掉多余的极性基团或增加脂溶性。如果信号强但集中在细胞膜上不进去说明探针卡在膜上了可能需要调整Linker的亲水性。② 看分布模式。荧光主要在细胞质、细胞核还是特定细胞器如果你的靶蛋白是胞内蛋白但探针只停留在细胞膜上那后续的标记实验肯定效果不好。这种情况下可以考虑在Linker上加一个核定位信号或者换用更亲脂的探针结构帮助穿膜。③ 跟靶蛋白共定位。如果有靶蛋白的抗体或荧光融合蛋白做共定位——探针信号和靶蛋白信号重叠得越好越说明探针确实奔着靶点去的。验证方法二流式细胞术定量共聚焦看图好看但定量不精确。流式细胞术可以给每个细胞打分客观比较不同探针、不同浓度、不同时间点的摄取效率差异数据更硬。3. 标记效率验证从凝胶荧光到质谱定量表型也过了细胞也进了接下来该回答最核心的问题探针到底能不能有效地标记靶蛋白标记的信号够不够强、够不够干净方法一凝胶荧光成像——快速初筛最常用这是每个ABPP实验室的日常操作流程不复杂① 探针与细胞裂解液或活细胞孵育 → UV照射交联② 点击荧光染料比如TAMRA-N₃③ SDS-PAGE跑胶④ 荧光凝胶成像系统扫描看条带。怎么看结果▶条带数量如果凝胶上几乎看不到条带说明标记效率极低需要优化探针浓度、UV 照射时间或点击反应条件。▶条带模式高质量的探针应该呈现出清晰、可重复的条带模式而不是一片模糊的涂抹状信号后者通常意味着大量非特异性标记。▶浓度梯度设置探针浓度梯度如 0.1、0.5、1、5、10 μM观察标记信号是否随浓度增加而增强并找到饱和标记浓度。方法二Western Blot验证已知靶点如果你的母体分子有已知的靶蛋白文献里报道过的那就好办了。探针标记、富集后Western Blot检测该靶蛋白是否被有效富集。方法三定量蛋白质组学对于更系统的验证可以采用定量质谱来评估探针的标记效率和特异性。通过比较探针标记组与对照组的蛋白丰度可以定量计算每个蛋白的富集倍数。4. 竞争实验结合特异性的金标准前面三步验证回答的是“探针能不能用”。而竞争实验回答的是“探针标记的蛋白到底是不是特异性的”。▶实验原理如果探针是通过特异性结合靶蛋白的活性位点来实现标记的那么过量的母体分子应该能够竞争性地占据这些结合位点从而显著抑制探针的标记信号。反之如果某个蛋白的标记信号不能被母体分子竞争掉说明它很可能是非特异性结合蛋白。▶标准实验设计组别处理方式目的探针组仅加入探针如 1 μM基线标记水平竞争组先加入过量母体分子预孵育再加探针检测特异性结合空白对照组不加探针仅 UV 照射 点击检测非特异性背景▶关键参数怎么设① 竞争剂浓度我们一般用探针浓度的10100倍。比如探针1μM竞争剂就设10μM10×和100μM100×两个浓度一起跑。浓度越高竞争越彻底但也要注意过高浓度的母体分子可能引起非特异性效应导致假竞争。② 预孵育时间母体分子必须比探针先加进去预孵育至少30分钟最好1小时让它充分占住结合位点再加入探针进行标记。时间太短竞争效果打折扣。▶怎么看结果① 特异性靶点标记信号被竞争剂显著抑制通常抑制率 50%的蛋白很可能是探针的特异性结合蛋白。② 非特异性结合蛋白标记信号基本不受竞争剂影响的蛋白通常为非特异性结合后续数据分析中应予以排除。③ 剂量依赖性更严谨的做法是设置竞争剂的浓度梯度如 1 倍、10 倍、100 倍观察标记信号的抑制是否呈现剂量依赖性 —— 这是特异性结合的有力证据。二、 实战建议与常见坑点理论讲完了接下来聊聊实战中每个做ABPP的人几乎都会遇到的问题。1. 探针合成阶段问题现象成因解决方案双吖丙啶探针产物降解强酸、高温、长期光照全程弱光操作规避浓酸回流产物棕色瓶避光-20℃长期保存合成探针完全无生物活性修饰位点落在配体核心结合区、Linker 位阻过大查阅 SAR 文献 / 分子对接选溶剂暴露位点更换更短 PEG 炔烃 Linker多合成 2~3 种修饰异构体筛选探针杂质多背景信号高粗产物未深度纯化、副产物残留制备 HPLC 纯化至纯度95%HRMSNMR 双重鉴定结构2. 标记实验阶段问题现象成因解决方案凝胶全片模糊、背景极高探针浓度过高UV 照射超时裂解不完全点击反应配比失衡梯度下调探针浓度UV 控制 10~15 min充分裂解去除蛋白聚集体优化 CuSO₄/TCEP/TBTA 配比凝胶几乎无标记条带、信号极弱膜通透性差UV 剂量不足靶蛋白丰度低叠氮试剂失效提升探针浓度 / 延长孵育适度增加 UV 照射富集后 WB 验证更换新鲜叠氮荧光 / 生物素试剂竞争实验无明显信号抑制竞争剂倍数不足预孵育时间短探针为不可逆共价弹头探针整体特异性差竞争剂提升至 100 倍预孵育 1 h设计反向对照返回重新优化探针分子结构3. 数据解读阶段的常见问题问题现象成因解决方案质谱富集蛋白数量过多难以筛选真假靶点缺少对照、无生物学重复设置空白 竞争双对照至少 3 次生物学重复统计学筛选双重差异蛋白频繁富集骨架、分子伴侣等高丰度蛋白非特异性吸附假阳性高发蛋白重点核验 Actin、Tubulin、HSP70/90建立实验室背景蛋白库候选靶点必须开展细胞功能验证结语整套方案是我们实验室这些年的实战总结希望能帮你们把探针开发的路走得更顺一些。ABPP实验七分靠探针三分靠运气 ——而那三分运气往往就藏在别人懒得做的验证细节里。表型验证、细胞摄取、标记效率、竞争实验每一步都做到位你的数据自然经得起审稿人和同行检验。祝大家探针一次合成成功胶图条带清晰靶点一抓就中少熬几个夜多出好数据。探针验证做扎实了靶点候选名单拿到手了但这些候选蛋白里到底哪个才是药物真正作用的核心靶点常规的GO/KEGG分析给不了答案你需要的是一套能直接从差异蛋白里“揪出”转录因子、激酶、受体和已知药物靶点的分析方案还得把“药物-靶点-差异蛋白”的调控网络给画清楚。下面这套谱度众合的药物机制蛋白质组学解决方案正好能接上这一步⬇️⬇️⬇️药物机制蛋白质组学解决方案——系统解析药物诱导的蛋白质动态扰动无偏倚发现在靶和脱靶靶点客户仅需提供药物处理前后的细胞、组织、体液等实验材料及药物相关信息即可获得远超常规蛋白质组学服务的分析内容除GO、KEGG外本方案还包括Pfam结构域、亚细胞定位、WikiPathway、转录因子、Reactome、GSEA等多维功能解析。三大专属模块让您的药物机制研究更深入、更精准① 药物靶点数据库关联自动从差异蛋白中挖掘转录因子、激酶、离子通道、受体及已知药物靶点快速锁定候选分子类别。② TTD药物靶点整合网络引入药物已知靶点构建“药物-靶点-差异蛋白”层级网络全景揭示药物调控路径。③ 分子对接验证对关键蛋白与药物进行结构模拟评估结合模式与亲和力为靶点验证提供理论依据。此外我们还提供多数据库功能注释、多维度关键蛋白筛选、多维特征预测等配套分析报告参照SCI论文标准撰写数据挖掘深度更优。从方案设计到论文发表我们的资深学术顾问与生信专家团队已准备就绪为您提供全周期专业支持。参考资料1. Schnalzer D, Savic V, Cziegler C, Schnirch M, Mihovilovic MD. Diazirines beyond photoaffinity labeling: a comprehensive overview of applications in biological sciences, materials chemistry, and NMR-spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 2025;e14105. doi:10.1002/anie.2025141052. Burton NR, Kim P, Backus KM. Photoaffinity labelling strategies for mapping the small molecule-protein interactome. Org Biomol Chem. 2021;19:7792-7815. doi:10.1039/d1ob01353j3. Fang H, Peng B, Ong SY, Wu Q, Li L, Yao SQ. Recent advances in activity-based probes (ABPs) and affinity-based probes (AfBPs) for profiling of enzymes. Chem Sci. 2021;12:8288-8310. doi:10.1039/d1sc01359a4. MacKinnon AL, Taunton J. Target identification by diazirine photo-affinity labeling using click chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 2009;1(1):55-73. doi:10.1002/9780470559277.ch090213