类器官原代培养无菌预防及细胞房除菌攻略

一、概述类器官污染是一个老生常谈的事情尤其是做胃肠道组织本身带来的菌群数量非常庞大一旦消毒不到位就会导致类器官培养失败。上一期我们学习了类器官污染鉴别与除菌攻略接下来小爱带大家了解类器官原代培养无菌预防及细胞房除菌方案。二、原代培养无菌预防1、预防无菌各个环节2、取样及保存无菌预防注意无菌性1为预防污染可在组织保存液中加入1%双抗2组织保存液体积要能浸没整个组织一般5-10mL3取样瓶要保证无菌也可以用15mL或50mL无菌离心管当取样管4用酒精棉消毒过的镊子将组织放入含有组织保存液的取样瓶中5手术切除的组织需立即转入含有组织保存液无菌取样瓶中。保存及运输条件14℃保存冰袋运输2越早做成功率越高当天做最佳最晚不超过48h。3、原代培养试剂抗生素添加指南抗生素组织保存液缓冲液组织消化液类器官培养基青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(100×三抗)稀释1:50稀释1:25稀释1:50稀释1:100硫酸庆大霉素溶液(10mg/mL)稀释1:100稀释1:50稀释1:100稀释1:200备注三抗青霉素10kU/mL链霉素10mg/mL两性霉素B25µg/mL。工作浓度稀释100X青霉素100U/mL链霉素100ug/mL两性霉素B 0.25µg/mL。庆大10mg/mL。工作浓度200X—20000X0.5ug/ml-50ug/mL4、细胞房着装要求操作细胞培养物前后应洗手。穿戴个人防护设备不仅可保护您免受危险品污染还可降低皮屑以及衣服上污物和灰尘污染培养物的可能。正确的穿衣顺序1换专用鞋2无尘手套避免不洁的双手经穿着时沾附于无尘衣上3网帽带网帽时须确保头发不可暴露于网帽外之后戴口罩遮住口鼻4无尘服不要穿棉质衣服(脱落纤维)5鞋套5、超净台试剂布局适合惯用右手的工作人员的工作台基本布局。惯用左手的工作人员可相应地调整工作台面上物品的摆放位置(图源网络)超净工作台或安全柜里的物品摆放一般遵循以下右手试用习惯并可根据特殊实验中增加物品进行相应的改动。1在工作台中部开阔区域放置细胞培养容器2移液器置于右前方易于取用的地方3试剂和培养基置于右后方便于吸取4试管架置于中后部用于固定其他试剂5小型容器置于左后部用于盛放废液。6、人为操作技巧1小心取用无菌实验物品勿碰触吸管尖头部或容器瓶口也不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后以手夹住瓶盖并握住瓶身倾斜约45°角取用尽量勿将瓶盖盖口朝下放置桌面。2每次操作只处理一株细胞株且即使培养基相同也不共享培养基以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后将实验物品带出工作台以75%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10min以上后再进行下一个细胞株之操作。3离心管、冻存管等容器需用抗酒精的标记笔标示内容物名称、操作日期、操作人员姓名。若是细胞传代培养更需注明目前的代数以及这是同一代中的第几盘。三、细胞房除菌方案细胞房主要做好清洁和消毒工作小爱汇总了目前细胞房常用的消毒试剂种类及作用原理供大家了解。除菌剂种类及作用原理种类作用原理特点醇类除菌剂乙醇的抗菌原理是使蛋白质变性易挥发作用时间短刺激性易燃含氯除菌剂通过新生态氧的极强氧化性使菌体和病毒的蛋白质变性从而使病原微生物致死。刺激性腐蚀性醛类除菌剂使蛋白中的氨基和巯基烷基化来灭活微生物刺激性致癌性过氧化物类除菌剂通过羟基的强氧化性破坏组成细菌的蛋白质刺激性腐蚀性含碘除菌剂通过氧化性破坏病原体原浆蛋白的活性基因并与蛋白质的氨基结合而使其变性沉淀刺激性腐蚀性酚类除菌剂酚类可裂解并穿透细胞壁使菌体蛋白凝集沉淀刺激性易使橡胶制品变脆变硬环氧乙烷除菌剂环氧乙烷与蛋白质分子发生烷基化反应易燃易爆毒性大双胍类和季铵盐类除菌剂破坏细菌的细胞膜增加细菌胞浆膜通透性使菌体胞浆物质外渗无刺激性无腐蚀性可生物降解1、仪器设备、物体表面除菌方案适宜微生物增殖的主要条件是温暖潮湿的地方比如培养箱、水盘、水浴锅等。培养箱除菌剂特点广谱高效专门用于清除CO2培养箱内的细菌、真菌及支原体等微生物污染安全性高无刺激无腐蚀不挥发使用方便直接喷洒即可省时省力。用法1、移除细胞后直接对细胞培养箱的隔板、内壁喷洒适量也可倒出少许将脱脂棉球浸泡后擦拭使用2、建议一周处理一次配合培养箱水盘除菌剂使用效果更佳。遇污染爆发时期如梅雨季节等可适当增加用量。细胞房除菌剂特点具有很强的抑菌功能可用于细胞房的污染控制通过清除细胞房内细菌、真菌及其孢子可有效防止细胞的污染从而减少由于细胞污染带来的人力、财力、时间方面的浪费。用法1直接对细胞房的死角、墙面、空间进行喷洒也可倒出少许将脱脂棉球浸泡后擦拭使用。 建议一周处理一次配合紫外线使用效果更佳。2建议每立方米(m³)使用量为5-8mL如10m2、高3m的房间推荐用量为150mL。遇污染爆发时期如梅雨季节等可适当增加用量。若室内墙壁上有霉菌生长可喷洒于墙壁表面或者用浸泡后的棉球擦拭。水盘抑菌剂特点用来消毒培养箱中的水盘可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌酵母菌、霉菌和病毒无毒对不锈钢无腐蚀性不挥发。用法1建议每周进行一次系统地清洁和消毒培养箱水盘。2稀释100倍即可使用即将1升水中加入10mL的水盘抑菌剂。水浴锅抑菌剂特点用来消毒水浴锅可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌酵母菌、霉菌和病毒。用法1建议每周进行一次系统地清洁和消毒水浴锅。2稀释500倍即可使用即将1升水中加入2mL的水浴锅防菌剂。2、细胞房空气消毒方法空气污染不容小觑气溶胶污染也是细胞房常见的污染途径小爱整理了常见的空气消毒方法如下灭菌方法作用原理特点紫外线灯杀菌波长在260nm的杀菌力最强紫外线作用于细胞DNA穿透力差有死角致癌臭氧灭菌通过臭氧分解的单个氧原子的强氧化性破坏细菌的胞膜蛋白灭菌彻底残留性小费用较为昂贵空气过滤(恒温恒湿装置)逐次使用不同孔径的滤膜将微生物过滤干净灭菌彻底无毒费用较为昂贵3、细胞房地面消毒方法地面是细胞房最常忽略的地方通常脚底带来的微生物污染也是导致细胞房污染爆发的关键因素之一小爱整理了常用的地面清洁剂供大家参考。灭菌剂作用原理特点84消毒液次氯酸钠次氯酸钠的水解产物次氯酸进一步分解形成新生态氧[O]新生态氧的极强氧化性使菌体和病毒的蛋白质变性灭菌彻底残留性小有腐蚀与氨或酸(如洁厕灵)混合时易释放出有毒氯气新洁尔灭苯扎溴铵季铵盐类消毒剂属于阳离子表面活性剂能吸附带阴离子的细菌并破坏细菌的细胞膜增加细菌胞浆膜通透性。可杀灭常见细菌、真菌刺激性低无腐蚀来苏尔甲酚酚类可裂解并穿透细胞壁使菌体蛋白凝集沉淀快速杀灭细胞。可杀灭常见细菌、真菌、刺激性强易使橡胶制品变脆变硬