文献速递 | 张金方团队揭示免疫检查点PD-1调控新机制和肿瘤联合治疗新策略

文章信息期刊Nature Communications影响因子IF16.62023年标题ERK and USP5 govern PD-1 homeostasis via deubiquitination to modulate tumor immunotherapy作者张金方课题组作者单位武汉大学医学研究院引用产品USP5 Protein, Human, Recombinant (His Tag)货号12772-H08B产品应用通过免疫印迹试验检测体外去泛素化结果文章摘要PD-1是T细胞上的一种抑制性受体在促进癌症免疫逃逸方面具有重要作用。调节PD-1稳定性的泛素E3连接酶已有报道但去泛素酶却仍未知。近期武汉大学医学研究院的张金方研究团队发现泛素特异性蛋白酶-5USP5是PD-1的去泛素化酶。机制研究证实USP5与PD-1相互作用导致PD-1的去泛素化和稳定化。细胞外信号调节激酶ERK会使PD-1在Thr234处磷酸化促进PD-1与USP5的相互作用。有条件的敲除T细胞中的USP5会增加效应细胞因子的产生并延缓小鼠肿瘤的生长。研究人员发现联合使用USP5抑制剂与MEK抑制剂或抗-CTLA-4抗体在多种小鼠肿瘤模型中具有更好的治疗效果。总之该研究不仅揭示了免疫检查点PD-1调控的新机制而且还提出了肿瘤治疗的新策略具有潜在的临床转化意义。研究背景PD-1/PD-L1或CTLA-4的免疫检查点抑制剂已广泛用于治疗多种癌症。但随着临床治疗的深入该疗法总体上仅对20-30%的患者有效。如何提高免疫检查点抑制剂的治疗效率是目前肿瘤研究领域的热点和前沿问题之一。PD-1又称CD279在活化的T细胞表达与肿瘤细胞或其他免疫细胞上的配体结合分别为PD-L1又称CD274、B7-H1和PD-L2又称CD273、B7-DC。PD-1与配体结合导致T细胞功能障碍和肿瘤免疫逃避。对PD-L1调控已有多层面的研究但对PD-1尤其是翻译后层面的研究较少。泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰PTM在调节蛋白质稳定性和相互作用中发挥作用维持各种细胞过程。泛素化和去泛素化过程是可逆的受E3连接酶和去泛素化酶DUBs调控。研究发现FBXO38、KLHL22、c-Cbl等E3连接酶促进PD-1的泛素化和随后的降解增强T细胞的抗肿瘤效应然而调节PD-1的去泛素酶仍未有报道。研究结果01去泛素化酶USP5是PD-1的正向调节因子首先从4种去泛素化酶USP5、USP10、USP15和OTUB1中确定USP5是调节细胞中PD-1蛋白稳态的主要去泛素化酶。通过不同细胞系检测PD-1蛋白表达水平敲低USP5可显著降低Jukat和MOLT-4细胞中的内源性PD-1蛋白水平。异位表达USP5并没有明显改变PD-1 mRNA水平同样敲低USP5也没有引起PD-1 mRNA水平的变化结果表明USP5主要在翻译后水平正向调节PD-1蛋白的稳定性。EOAI3402143已被确定为一种同时靶向USP5、USP9x和USP24的通用抑制剂。本研究发现EOAI3402143主要通过靶向去泛素化酶USP5降低PD-1蛋白丰度。通过多重免疫组织化学染色检测人类直肠癌组织中的USP5和PD-1的蛋白表达结果显示USP5与PD-1在人类结直肠癌样本中的肿瘤浸润CD3 T细胞上共定位表明T细胞中高表达的USP5可能稳定PD-1从而抑制T细胞的细胞毒性功能导致肿瘤发生。02USP5与PD-1相互作用并使PD-1去泛素化免疫共沉淀实验证实USP5与PD-1结合亲和力强在Jurkat、MOLT-4和小鼠原代CD3 T细胞中检测到USP5与PD-1的内源性相互作用。USP5包含两个泛素结合相关结构域UBA1和UBA2。结果发现USP5通过UBA1和UBA2与PD-1相互作用。PD-1突变体证实其192至240位氨基酸残基区域可能是与USP5相互作用的关键。体内泛素化试验表明异位表达USP5可特异性去除PD-1的泛素化酶失活则不能去泛素化。来自杆状病毒-昆虫细胞表达的重组USP5蛋白可在体外直接去泛素化PD-1。表明USP5特异性地与PD1相互作用并去除细胞中PD-1的泛素化。03ERK使PD-1稳定并在Thr234处磷酸化磷酸化和泛素化是两种重要的翻译后修饰它们之间的相互作用在调节蛋白质的命运和功能方面起着重要作用。研究团队发现ERK1、GSK3β、CDKs、AKT中ERK1是最有效提高细胞中PD-1蛋白丰度的激酶。表达ERK上游刺激因子RAS或BRAF也能提高PD-1蛋白水平。IHC结果显示磷酸化ERK与结直肠癌样本中的PD-1共定位。此外ERK1的异位表达显著延长PD-1蛋白的半衰期表明ERK信号可能在翻译后水平上稳定PD-1。通过开发磷酸化抗体进一步验证ERK直接与PD-1相互作用并磷酸化PD-1的Thr234位点。本研究发现ERK、USP5和PD-1同时存在于内质网和高尔基体中但N-连接糖基化和PD-1在T234位点的磷酸化可能互不影响而是通过两条平行的途径调节PD-1在不同生理或病理条件下的稳定性和定位。04ERK介导的磷酸化可促进PD-1与USP5的相互作用Co-IP实验结果发现异位表达ERK或其上游激活因子KRAS或BRAF可显著增强PD-1与USP5的相互作用。相反抑制ERK活性可显著降低细胞中PD-1与USP5的相互作用。磷酸化缺陷型突变体与USP5的相互作用减弱。重组人USP5蛋白与ERK1磷酸化的GST-PD-1192-288在体外具有高亲和力。与PD-1野生型相比磷酸化缺陷突变体被大量泛素化对USP5介导的去泛素化具有抗性。抑制ERK的活化能够抑制USP5介导的PD-1的去泛素化。敲低ERK1/2抑制ERK的活性显著提高Jurkat细胞中内源性的PD-1泛素化水平。并发现ERK介导的PD-1的Thr234磷酸化促进PD-1与USP5相互作用导致去泛素化和PD-1的稳定。05Usp5条件性基因敲除小鼠可有效控制肿瘤与对照组相比与USP5缺陷的细胞共培养的MC38细胞的凋亡明显增加表明敲低USP5可以增强CD8 T细胞对MC38肿瘤细胞的细胞毒性。与野生型小鼠相比USP5缺陷不影响T细胞的发育和记忆T细胞群体。进一步研究发现T细胞中Usp5的缺失促进了CD8 T细胞的活化但可能不影响CD4 T细胞和Treg细胞的功能。小鼠皮下肿瘤模型结果显示Usp5 cKO小鼠的MC38肿瘤生长速度更慢存活时间更长。T细胞中的Usp5缺陷主要通过减少CD8 T细胞中的PD-1表达来增强抗肿瘤免疫。同时抑制USP5介导的PD-1在癌细胞和CD8 T细胞中的表达进一步增强抗肿瘤免疫力。USP5抑制剂与Trametinib或CTLA-4阻断剂联合使用对抑制肿瘤生长具有协同作用。联合抑制USP5和ERK活化可能会对降低PD-1蛋白丰度产生叠加效应更好地控制肿瘤生长在不同的临床前肿瘤模型中联合靶向USP5和ERK信号对减少PD-1和抑制肿瘤生长具有叠加效应。研究结论本研究发现USP5是PD-1的特异性去泛素化酶ERK会直接将PD-1胞质尾部的Thr234残基磷酸化主要通过促进PD-1/USP5的相互作用来稳定PD-1从而减少PD-1的泛素化和降解。在CD8T细胞中敲除Usp5会降低PD-1蛋白表达增加IFN-γ、TNF和granzyme B等细胞因子和细胞毒性分子的产生。与野生型小鼠相比在T细胞中条件性敲除Usp5的小鼠能更好地控制肿瘤生长。USP5抑制剂与MEK抑制剂Trametinib或抗CTLA-4抗体联合使用对抑制小鼠的肿瘤生长具有叠加效应。