酵母双杂交伯远生物酵母双杂交

酵母双杂交伯远生物酵母双杂交伯远生物是国家级专精特新小巨人企业农业农村部生物育种重点实验室牵头多项省部级重大专项公司科研技术人员500硕博占比40%以上是国内最大植物功能基因研究综合性平台15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含清北、复旦、武大、华科等知名高校及所有农业类科研院所服务头部种业公司客户300余家涉及四十多个物种含水稻、玉米、小麦、马铃薯、大豆五大主粮以及禾本科高粱、甘蔗葫芦科黄瓜、西甜瓜茄科番茄、辣椒与十字花科等100多个品种的50多个性状含抗虫抗病、抗除草剂、品质提升、株型改良等各类仪器设备投资超1个亿高标准恒温繁育基地200亩案例展示文献举例结果分析①Positive control为阳性对照。在DDO上可以正常长出菌斑说明质粒成功共转进酵母细胞且在TDO/X和QDO/X因为存在相互作用激活下游报告基因转录所以能够长出菌斑。X-α-gal中同理在报告基因作用下长出菌斑且变蓝。②Negative control为阴性对照。在DDO上可以正常长出菌斑说明质粒成功共转进酵母细胞而在QDO/X因为无相互作用无法激活下游报告基因转录所以不能长出菌斑。同理也无法与X-α-gal发生作用使菌斑变蓝。③pGBKT7-Bait1 x pGADT7为自激活检测组。在DDO上生长说明质粒转化正常未在QDO/X生长并变蓝证明没有自激活。④pGBKT7-Bait1 x pGADT7-Prey1为实验组。在DDO上生长说明质粒转化正常在QDO/X生长并变蓝证明实验组存在相互作用。结论Bait1 Prey1存在相互作用。其中DDO-trp-leuQDO/X-trp-leu-his-adeX-α-gal。背景说明背景说明Fields在1989年发明了酵母双杂交技术打开了蛋白质相互作用筛选的快捷通道。这项技术的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究GAL4包括两个结构域即DNA结合结构域DNA-binding domainBD和转录激活结构域Activating domainAD。BD能够识别位于GAL4效应基因GAL4-responsive gene的上游激活序列Upstream activating sequenceUAS并与之结合AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD分别单独作用并不能激活转录但是当二者在空间上充分接近时则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子转录启动子下游基因并使其表达。在酵母双杂交系统中BD与X蛋白融合AD与Y蛋白融合如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物AD与BD会在空间上充分接近重新构成结构域启动报告基因的转录。拥有BD质粒的酵母可以在某一缺陷培养基上生长拥有AD质粒的酵母菌可以在另一种缺陷培养基上生长通过接合mating或共转化使酵母同时拥有AD与BD质粒。如果BD上的目的蛋白与AD上的猎物蛋白存在相互作用这样的酵母可以在四缺的培养基上生长并启动α-半乳糖苷酶基因。酵母双杂交系统由三个部分组成1与BD融合的蛋白表达载体被表达的蛋白称诱饵蛋白bait。2与AD融合的蛋白表达载体被其表达的蛋白称靶蛋白prey。3带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3MEL1LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。表 我司酵母双杂系统。图 酵母双杂原理图。服务流程服务流程载体构建——诱饵自激活验证——互作验证——实验报告服务内容及说明服务内容及说明项目流程及周期以转化AH109菌株为例适用场景1、高灵敏度地检测蛋白-蛋白的交互作用2、寻找在蛋白-蛋白交互作用中起关键作用的结构域或活性位点3、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白4、寻找具有药物治疗作用的小分子多肽5、寻找调控蛋白质相互作用的化合物6、绘制蛋白质相互作用图谱。交付标准在没有自激活的情况下所有共转的酵母菌在二缺板DDO上可以正常长出菌斑且阳性对照可以在四缺板QDO上生长并在添加X-α-gal的情况下变蓝阴性对照不能在四缺板上生长。交付结果产品优势1、实验结果可靠、图片美观2、我司除了酵母双杂业务还可以提供多种其它的蛋白互作业务可同时下单多个蛋白互作实验相互验证多种实验结果可一步到位。材料要求客户需要我司构建酵母双杂载体可根据以下要求寄送材料。客户下单及项目信息填写在我司官网/进行注册或登录请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式提交项目所需要的具体信息包括1、BD与AD质粒及相关序列信息2、尽可能丰富的相关资料、文献。实验信息实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户并发送实验报告查看网址。实验结题后实验报告、检测结果可在线查看或打印并永久保留。酵母双杂交技术的优点1、无需纯化蛋白2、检测在活细胞内进行可以在一定程度上代表体内的真实情况3、检测的结果是基因表达产物的积累效应因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用4、酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库并能分析细胞质、细胞核等多种亚细胞部位的蛋白。酵母双杂交技术的缺点1、酵母双杂并非对所有蛋白都适用其检测的融合蛋白必须定位于核内才能激活报告基因而融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内也是检测的前提条件很多不能被转运到细胞核内的蛋白如胞质蛋白、膜蛋白不适用此方法2、假阳性较多。在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型I型表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录II型表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录III型表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。因此和酵母单杂交一样为了得到更准确的结果一般都要和其它的实验方法结合使用。这其中部分假阳性来源于筛选对象具有类似转录因子的功能或在双杂交体系中能表现岀这种特性。部分假阳性原因不清可能与宿主酵母细胞中其他蛋白质的作用有关。3、在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白常会带来毒性作用从而影响菌株生长及报告基因的表达为抑制背景表达而在培养基中加入的3-AT3-Amino Triazole等物质也对菌株有一定的毒性使得一些较弱的蛋白质间的相互作用呈现出假阴性结果。4、虽然双杂交系统可筛选出大量相互作用的蛋白但其中部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长发育的不同时期生理状态下是不可能发生相互作用的。因此对于筛选对象和范围应有一个合适的选择。实验流程实验流程一、实验技术流程1、酵母菌株活化挑取AH109菌株划线于YPDA固体平板上于30℃培养2-3d2、酵母感受态细胞的制备1从YPDA平板上挑取生长2-3d、直径2-3mm的AH109单克隆菌落接入5-10mL YPDA液体培养基中震荡打散菌落30℃恒温250×g震荡培养过夜16-18h至OD6001.52取适量过夜接种约1-2mL菌液于100mL新鲜的YPDA液体培养基至OD6000.2-0.330℃恒温250×g震荡培养至OD6000.4-0.6约3h3室温20-25℃离心4000×g5min收集菌加入25-50mL 无菌水或TE重悬洗涤酵母沉淀细胞离心弃上清洗涤一次转移至1.5mL Ep管中用1mL 1×TE/LiAc重悬离心弃上清洗涤一次然后加入1.5mL 1×TE/LiAc即为酵母感受态细胞。3、质粒共转按下表进行质粒共转化至AH109感受态中。4、点板验证1分别挑取上述4个DDO上各6个生长至2-3mm的菌落加入到100μL 0.9% NaCl 溶液中混匀2把上述四种菌液分别点板到DDO、QDO/X固体培养基每个培养基点5μL菌液。30℃倒置培养3-5d直到待菌落长出。二、实验重难点培养条件如温度和湿度等条件不正确会影响酵母菌落的生长酵母菌接种量接种的酵母细胞数量太少可能会导致菌落生长缓慢培养基的成分或pH值不正确可能会影响酵母菌落的生长。三、与其他同类型实验相比优势与劣势优势1、无需纯化蛋白2、检测在活细胞内进行可以在一定程度上代表体内的真实情况3、检测的结果是基因表达产物的积累效应因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用4、酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库并能分析细胞质、细胞核等多种亚细胞部位的蛋白。劣势:1、核体系酵母双杂实验并非对所有蛋白都适用其检测的融合蛋白必须定位于核内才能激活报告基因而融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内也是检测的前提条件很多不能被转运到细胞核内的蛋白如胞质蛋白、膜蛋白不适用此方法2、在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白常会带来毒性作用从而影响菌株生长及报告基因的表达为抑制背景表达而在培养基中加入的3-AT等物质也对菌株有一定的毒性使得一些较弱的蛋白质间的相互作用呈现出假阴性结果。四、我司该实验业务优势1、实验结果可靠、图片美观2、我司除了酵母双杂业务还可以提供多种其它的蛋白互作业务可同时下单多个蛋白互作实验相互验证多种实验结果可一步到位。五、常见问题答疑1、酵母双杂交出现假阳性的原因如何解决A由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用或者其激活作用被外来蛋白激活。因此需要作严格的对照试验对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定以排除假阳性。可以选择多个报告基因HIS3ADE2MEL1进行更为严格的筛选每个报告基因的上游调控区各不相同这可减少大量的假阳性或者通过适当提高AbA或3-AT的浓度。另外报告基因整合到染色体上可以使基因表达水平稳定消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。2、涂板或者点板怎么设定菌浓度呢A涂板或者点板生长出来的菌落为单菌落无论菌落密集程度只要平板菌落是单菌落的状态不成片也不成团那么该菌浓度在合理范围重复实验的筛选浓度也以此为准。涂板时建议菌浓度OD值为0.002直径9cm的培养皿涂布100μL点板时控制初始菌浓度OD值0.1-0.5之间常设0.2按十倍梯度再稀释3个浓度每个浓度点10μL。AbA或者3-AT的有效浓度只以OD值0.0002的菌浓度的筛选结果为准此浓度菌在不含筛选性的平板上理论上可以得到20个单菌落。