卡梅德生物技术快报：scFv 抗体可溶性表达优化，基于 CH1/Cκ 恒定域融合的载体构建与实验实现

一、scFv 抗体表达体系的核心设计思路scFv 抗体由 VH 与 VL 域通过柔性连接肽串联而成缺少恒定域的结构支撑导致其在大肠杆菌中表达时易折叠错误、形成包涵体。基于免疫球蛋白结构研究CH1 与 Cκ 恒定域可通过空间结构支撑与二硫键形成辅助抗体片段正确折叠因此本研究将 scFv 抗体与 CH1、Cκ 域进行基因融合同时引入 Skp 分子伴侣共表达构建 “scFv - 恒定域 - Skp” 的组合表达体系从结构层面提升 scFv 抗体的可溶性。载体以 pHAL14 为骨架通过酶切位点改造与基因克隆实现恒定域、Skp 与 scFv 抗体的定向融合表达。二、scFv 抗体表达载体的构建与验证基础载体改造在 pHAL14 的 NotI 与 His 标签间引入 BglII 酶切位点替换 g3p 基因构建 pT1 基础载体2. 恒定域克隆从人 IgG 载体中扩增 CH1、Cκ 域基因分别克隆至 pT1构建 pT3scFv-CH1 融合、pT4scFv-Cκ 融合载体3. Skp 分子伴侣克隆将 Skp 基因克隆至 pT1、pT3、pT4获得 pT2、pT5、pT6 载体4. 载体验证所有载体经菌落 PCR 与 Sanger 测序验证确保基因序列无突变、酶切位点匹配可实现 scFv 抗体的定向克隆。三、scFv 抗体的克隆与可溶性预测选取两款经噬菌体展示筛选的 scFv 抗体克隆采用 NcoI/NotI 双酶切将 scFv 抗体基因定向克隆至 pT2-pT6 载体目的片段与载体按 5:1 摩尔比连接转化 XL1 Blue 感受态细胞。经菌落 PCR 筛选阳性克隆后利用 SoluProt v1.0、DeepSoluE、SCRATCH 三款在线工具对 scFv 抗体融合蛋白进行可溶性预测当预测概率均0.5 时进行后续表达大幅提升实验成功率。四、scFv 抗体的大肠杆菌表达与蛋白提取将验证正确的 pT-scFv 载体转化 SHuffle® T7 感受态细胞该菌株可在细胞质内形成正确二硫键突破周质表达的空间限制。挑取单菌落经 2xYT 培养基活化后1:100 转接至新鲜培养基37℃培养至 OD6000.6-0.8 时加入 0.1mM IPTG分别在 25℃、30℃下 160rpm 诱导过夜。采用 TES 渗透休克法提取周质蛋白预冷 TES 缓冲液重悬菌体冰浴 1h 后 8000×g 离心 10min上清即为含可溶性 scFv 抗体融合蛋白的粗提液。五、scFv 抗体的检测、筛选与纯化通过 12% SDS-PAGE 结合 Western Blot 检测粗提液以 Myc 标签抗体为一抗进行免疫染色ImageJ 软件对条带密度分析热图可视化不同载体、温度下的 scFv 抗体表达量筛选最优表达体系。将最优体系扩大至 500mL 培养采用 Ni-NTA 亲和层析纯化经 20mM、40mM 咪唑梯度洗涤300mM 咪唑洗脱Bradford 法定量纯化后 scFv 抗体经 SDS-PAGE 验证为单一条带分子量与理论值一致可溶性与纯度均满足后续实验需求。本方案通过恒定域融合策略成功实现了 scFv 抗体的高效可溶性表达载体的模块化设计可直接对接噬菌体展示流程大幅缩短 scFv 抗体从筛选到表达的研发周期为 scFv 抗体在生物研发中的规模化应用提供了实用技术支撑。